雌激素受体介导的柚皮苷抗A...伤PC12细胞凋亡作用研究_王媛.pdf

63第 2 5 卷 第 2 期 2023 年 2 月辽 宁 中 医 药 大 学 学 报JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCMVol.25 No.2 Feb.，2023雌激素受体介导的柚皮苷抗A25-35损伤PC12细胞凋亡作用研究王媛1，武凤1，熊辉1，徐艳明2，雷霞1，徐红丹2，孙慧峰1，张宁1，2，杨波1（1.黑龙江中医药大学，哈尔滨 黑龙江 150040；2.黑龙江中医药大学佳木斯学院，佳木斯 黑龙江 154007）基金项目：国家自然科学基金面上项目（81673581）；国家科技重大专项（2018ZX09201009）；黑龙江省属高校科技成果研发、培育项目 （TSTAU-C2018020）；黑龙江省卫生健康委科研课题（2020-301，2020-303）；黑龙江中医药大学科研基金项目（2018jkcy05，2018pt04，2019BJP01）作者简介：王媛（1997-），女，山东泰安人，硕士在读，研究方向：中药药效物质基础及体内代谢研究。通讯作者：杨波（1972-），男，辽宁铁岭人，副研究员，硕士研究生导师，博士，研究方向：中药药效物质基础及质量评价研究。摘要：目的 探讨雌激素受体介导的柚皮苷（NG）抗淀粉样蛋白25-35（A25-35）诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤（PC12）细胞的凋亡作用及其与雌激素受体（ER）信号通路的关系。方法 实验分为空白组、A25-35组、E2+A25-35组、NG+A25-35组、ICI182780+E2+A25-35组、ICI182780+NG+A25-35组。实验采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率；蛋白免疫印迹法（WB）检测细胞Bax、Bcl-2和Caspase-3的表达；RT-qPCR法检测细胞凋亡因子mRNA的表达。结果 Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞术结果显示，与空白组相比，A25-35组细胞凋亡率升高（P0.01）；与A25-35组相比，NG+A25-35组细胞凋亡率降低（P0.01）；与NG+A25-35组相比，ICI182780+NG+A25-35组细胞凋亡率升高（P0.01）。WB结果显示，与空白组相比，A25-35组细胞Bax和Caspase-3蛋白表达量升高（P0.01），Bcl-2则相反（P0.01）；与A25-35组相比，E2+A25-35组Bax和Caspase-3蛋白表达量降低（P0.01），Bcl-2则相反（P0.01）；雌激素受体介导的NG的作用与E2相似，而ICI182780逆转了NG的作用。RT-qPCR结果显示，NG对细胞Caspase-3、Bax和Bcl-2 mRNA表达的影响与蛋白结果一致。说明NG是通过激活ER信号通路发挥抗凋亡作用，作用与E2一致。结论 雌激素受体介导的NG有明显的抗凋亡作用，通过提高Bcl-2的正常表达，降低Bax和Caspase-3的正常表达发挥抗凋亡作用，其抗凋亡作用可能经ER介导。关键词：柚皮苷；淀粉样蛋白25-35；雌激素受体；抗凋亡作用中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1673-842X (2023)02-0063-05Effects of Estrogen Receptor-mediated Naringin on Apoptosis of A25-35 Injured PC12 CellsWANG Yuan1，WU Feng1，XIONG Hui1，XU Yanming2，LEI Xia1，XU Hongdan2，SUN Huifeng1，ZHANG Ning1，2，YANG Bo1（1.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150040，Heilongjiang，China；2.Jiamusi College，Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Jiamusi 154007，Heilongjiang，China）Abstract：Objective To investigate the effect of estrogen receptor-mediated naringin（NG）on the apoptosis of rat adrenal pheochromocytoma（PC12）cells induced by-amyloid protein25-35（A25-35）and its relationship with estrogen receptor（ER）signaling pathway.Methods The experiment was divided into blank group，A25-35 group，E2+A25-35 group，NG+A25-35 group，ICI182780+E2+A25-35 group，ICI182780+NG+A25-35 group.Annexin V-FITC/PI double staining was used to detect the apoptosis rate of cells.The expression of Bax，Bcl-2 and Caspase-3 were detected by western blotting（WB）.The mRNA expression of apoptosis factor was detected by RT-PCR.Results Annexin V-FITC/PI double staining flow 学，2016.12 赵辉，邢若丹，谢婷婷，等.葱白提取物对心肌梗死模型大鼠心肌纤维化及TGF-_1与Smad2蛋白表达的影响 J .医药导报，2020，39(5 )：604-609.13 邢明媚，韦知樱，许俊.降钙素基因相关肽与动脉粥样硬化 J .现代生物医学进展，2011，11(12 )：2398-2400.14 DUAN J X，ZHOU Y，ZHOU A Y，et al.Calcitonin gene-related peptide exerts anti-inflammatory property through regulating murine macrophages polarization in vitro J .Molecular immunology，2017，91：105-113.15 赵桂荣，于存娟，张义松，等.通窍活血汤联合康复训练治疗老年脑卒中后血管性痴呆（瘀血内阻证）疗效及对患者血管内皮活性物质的影响 J .四川中医，2021，39(3 )：145-148.16 黄丽，朱彩霞，张芹欣，等.四种开窍药对急性不完全性脑缺血再灌注损伤模型大鼠的脑保护作用 J .中国比较医学杂志，2018，28(8 )：77-82.17 李丹丹，姚红艳，孙凯.超微川芎茶调散对偏头痛模型大鼠-EP、CGRP的影响 J .现代医学与健康研究电子杂志，2020，4(3 )：1-3.18 吴辉，王帆，魏丹，等.白芷、吴茱萸、川芎对偏头痛大鼠血清NO，5-HT含量及脑干组织CGRP表达的影响 J .湖北中医药大学学报，2018，20(6 )：17-20.19 王宇，赵珊珊，郑玉敏，等.红花黄色素联合阿加曲班治疗急性脑梗死的疗效及对血清IL-8、ET-1、NO水平和血液流变学的影响 J .中西医结合心脑血管病杂志，2018，16(1 )：86-89.20 汪涛，马进海，张广华.红花黄色素注射液对高原地区颅脑损伤大鼠血浆CGRP含量及神经功能评分的影响 J .中药材，2017，40(3 )：699-702.21 王权.红花黄色素联合电针对颈性眩晕患者血清CRP、肝功能及CGRP水平及临床疗效的影响 J .辽宁中医杂志，2016，43(9 )：1965-1967.DOI：10.13194/j.issn.1673-842x.2023.02.01464 辽宁中医药大学学报 25 卷阿尔茨海默病（AD）是一种无法对患者身体进行精准诊断治疗的中枢神经系统功能退行的慢性疾病，且临床病因极其复杂，以记忆功能障碍与深度认知障碍结合为主要早期临床表现1。病理或者衰老情况下，A的产生和消除失去动态平衡，造成沉积，从而导致疾病的发生2。研究发现，A可通过激活涉及线粒体功能受损和细胞稳态的凋亡途径诱导神经元损伤和死亡。A还能增加Bcl-2、Caspase-3的表达，降低Bax的表达，最终引起细胞凋亡。因此调控AD神经元细胞凋亡最关键的还是调控凋亡相关因子。神经元细胞凋亡是导致AD患者认知功能障碍的因素之一，也是A25-35损伤PC12细胞的主要表现之一3。研究发现，AD患者雌激素水平低下，推测AD发病可能与雌激素有关。雌激素作为一种类固醇激素，可减慢AD发病进程，改善AD患者的认知能力。ER在雌激素调节控制中枢神经退行性疾病相关的细胞凋亡中发挥重要作用4。17-E2和选择性雌激素受体调节剂（雷洛昔芬和他莫昔芬）对A诱导产生的细胞毒性发挥神经保护作用，对AD有治疗作用，其通过ER介导5。虽然雌激素可改善AD的症状，但是长期使用具有极强的不良反应，易对身体产生不良影响，引发其他疾病。植物雌激素采用天然植物提取，不良反应小，应用广泛，具有良好的发展前景，对相关性肿瘤和内分泌疾病具有防治作用。中医认为，“肾主智”，肾虚是AD发生的内在机理。骨碎补具有补肾壮阳、补脾健胃等作用，可见骨碎补对AD的治疗有一定的辅助作用，但是其治疗机制尚不清楚。NG作为骨碎补的主要植物雌激素类成分，可通过血脑屏障发挥作用。已有研究证实，NG具有雌激素样作用，NG及其代谢物通过细胞增殖和子宫体质量增加的实验来测试雌激素活性，发现可通过选择性结合ER产生雌激素样作用。因此，NG可能通过ER信号通路发挥细胞抗凋亡作用。本实验提取骨碎补中的NG来探究治疗AD可能的作用机制。近年来，本课题组已经证实NG对 A25-35诱导损伤PC12细胞具有保护性作用。本实验用雌激素受体阻断剂ICI182780作用于PC12细胞，通过双染色流式细胞术检测PC12细胞的凋亡率，Westernblot和RT-qPCR法检测PC12细胞的凋亡基因的正常表达，并检测给予雌激素受体阻断剂ICI182780后对NG作用的影响，确定NG是否通过ER信号通路发挥抗凋亡的作用，为植物雌激素治疗AD可能的作用机制提供参考。1材料1.1 细胞高分化型大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤（PC12）细胞（批号：ZQ0150），上海中乔新舟生物科技有限公司。1.2 主要仪器和试剂Tprofessional standard PCR自 动 扩 增 仪（Biometra公司）；SmartChemi 500化学发光成像仪（北京赛智创业科技公司）；mini PROTEANTetra Cell电泳仪和Trans-Blot SD Cell半干转膜仪（BIO-RAD公司）；Nano-100微量分光光度计（杭州奥胜仪器有限公司）；产品批号L750N46的NG与E2（北京百灵威科技有限公司）；产品批号S1191的ICI182780（Selleck公 司）；产 品 批 号PR-0257的 兔 抗Bcl-2（北京中杉金桥生物技术有限公司）；产品批号bs-0081R的兔抗Caspase-3（北京博奥森生物技术有限公司）；产品批号BA0315-2的兔抗Bax（武汉博士德生物工程有限公司）。2实验方法2.1 药品的配制取E2 10.90 mg溶 解 于10 L的 二 甲 基 亚 砜（DMSO），配制母液，按需求梯度稀释成所需的使用浓度。取ICI182780 12.15 mg，使用20 L DMSO完全溶解后，配制母液，按需求梯度稀释成所需浓度的工作液。取A25-35 5 mg，使用30 L的DMSO溶解，加入33.3 mL PBS分次溶解，配制成所需浓度的母液，过滤除菌，制