大叶桉挥发油对铜绿假单胞菌...外抑菌效果及生物膜抑制作用_杨磊.pdf

论著基础研究基金项目：广西自然科学基金（）；广西崇左市科技计划项目（崇科攻）；广西壮族自治区卫生健康委员会自筹经费科研课题（）第一作者简介：杨磊，硕士，主管技师，研究方向：临床疾病疗效评估。通信作者简介：曹红艳，本科，主管技师，研究方向：临床疾病预后评估及监测。大叶桉挥发油对铜绿假单胞菌的体外抑菌效果及生物膜抑制作用杨 磊 黄 庆 高兴新 曹炳华 李浩辰 曹红艳（广西中医药大学第一附属医院检验科，广西南宁市；广西医科大学第一附属医院烧伤科，广西南宁市；广西壮族自治区民族医院介入科，广西南宁市；天津国际旅行卫生保健中心卫生检疫实验室，天津市；苏州中医医院检验科，江苏省苏州市）【摘要】目的 探讨大叶桉挥发油对铜绿假单胞菌的体外抑菌效果及生物膜抑制作用。方法采用水共沸蒸馏法制备大叶桉挥发油，使用气相色谱质谱分析法分析大叶桉挥发油的成分，并制备 浓度药敏纸片。采用平板涂布法测定大叶桉挥发油对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度（）。将 浓度药敏纸片均匀散在贴于涂有 细菌悬液的血平板上，观察抑菌环大小。构建 份铜绿假单胞菌生物膜模型，并随机分为观察组与对照组，各 份，观察组采用含 大叶桉挥发油的培养基进行培养，对照组采用含等量生理盐水的培养基进行培养，通过扫描电镜观察大叶桉挥发油对细菌生物膜的干预作用。采用实时荧光定量 检测两组铜绿假单胞菌生物膜中感应基因 的 表达情况。结果大叶桉挥发油中存在 种主要成分，即 蒎烯、柠檬烯、桉油精、莰烯、邻异丙基苯、松油醇、甲基（甲基乙烯基）环己醇乙酸酯。及以上浓度的大叶桉挥发油具有理想的抑菌效果，但任何浓度的大叶桉挥发油药敏纸片在血平板上均无法产生抑菌环。大叶桉挥发油对延缓铜绿假单胞菌生物膜的形成起到了一定的作用。观察组 表达量低于对照组（）。结论 大叶桉挥发油可直接抑制铜绿假单胞菌的生长，延缓铜绿假单胞菌生物膜的形成，下调铜绿假单胞菌生物膜 基因的表达从而降低其毒力，具有临床治疗铜绿假单胞菌感染的潜在价值。【关键词】铜绿假单胞菌；大叶胺；挥发油；感染；抑菌；生物膜【中图分类号】【文献标识码】【文章编号】（）：，（，；，；，；，；，）【】，（），（）；，（），【】，感染是临床上烧伤患者常见的并发症之一，可引起感染性休克，甚至引发多器官功能障碍综合征，是烧伤患者转归差、预后不良甚至死亡的重要影响因素。铜绿假单胞菌是导致烧伤创面感染的最常见致病菌。中医药由于具有药物来源广、价格低廉、毒副作用小、不易导致细菌耐药、在菌体内作用途径多样化、能产生多种药理效应等优点，已成为继抗生素之后又一抗感染药物研究的重点。大叶桉为桃金娘科植物，栽培于我国贵州、广西等地，民间常用桉叶糊剂治疗“股疮”（即下肢溃疡）、脚臭等，还可用于防止蚊虫叮咬。已有研究显示，桉树叶具有较好的抗菌消炎作用，。因此本研究旨在探索大叶桉挥发油对铜绿假单胞菌的体外抑菌效果及生物膜的抑制作用。材料与方法 实验材料及相关试剂 本研究所用铜绿假单胞菌标准菌株 购自上海复祥生物科技有限公司；实时荧光定量 检测相关提取、反转录及扩增试剂购自 公司（货号：、）。大叶桉树叶采自广西横县，并由广西中医药大学第一附属医院制剂室提取，采用与水共沸蒸馏法按大叶桉树叶与无菌去离子水的体积比为 进行挥发油的制备。扫描电镜（，型号：）由广西医科大学电镜室提供；实时荧光定量 检测、细菌生物膜模型构建、最小抑菌浓度（，）试验等均由广西中医药大学第一附属医院检验科完成。大叶桉挥发油及不同浓度含药培养基的制备采用蒸馏冷凝回流收集的方法，即与水共沸蒸馏法制备大叶桉挥发油。由于大叶桉挥发油不溶于水，因此采用助溶剂 进行助溶（挥发油与助溶剂体积比为 ），将大叶桉挥发油与 充分研磨混匀后制成可溶性挥发油。分别将 、可溶性挥发油，对应加入、培养基（上海碧云天生物技术有限公司，货号：）中，制备成含药浓度分别为、的含药培养基。将无菌空白药敏纸片（杭州特种纸业有限公司，批号：）浸泡于不同浓度含药培养基中，后取出并置于 烤箱充分干燥，以制成不同浓度的药敏纸片备用。大叶桉挥发油的气相色谱质谱分析使用 气相色谱仪和 质谱仪（公司）对大叶桉挥发油进行成分分析，色谱柱为 毛细管色谱柱（公司，批号：；规格：）。初始温度设置为 ，以 的速度升至 后保持 ，再以 将温度升高至 ，然后以 进一步升高至 ，保持 。设定流速为 、进样量 、分流比为 。质谱仪设置为电子电离模式，电离能为 ，入口温度为 ，离子源温度为 、柱流速为 。提取数据后，通过 标准质谱数据库（）分析挥发油成分。平板涂布法测定 使用接种环将 保广西医学 年 月第 卷第 期种菌通过三区划线法接种于血平板，置于 温箱培养 后获得单个菌落。取 生理盐水注入无菌试管，使用接种环取单个菌落充分混匀于生理盐水。用浊度计检测该细菌悬液的初始浊度，当浊度高于 （麦氏浊度单位）时，逐滴加入生理盐水并混匀，反之，若低于 则继续加入菌落并混匀，最终将菌液调整为 。取 的 细菌悬液 接种于 上述不同浓度的含药 培养基，置于 温箱培养 后转接血平板，观察细菌生长情况。大叶桉挥发油扩散性检测 使用涂布棒将事先配置好的 细菌悬液均匀涂于血平板上，然后将 浓度药敏纸片贴于血平板上，培养 后观察抑菌环大小。细菌生物膜模型的构建及扫描电镜观察 细菌生物膜模型的构建：取不含药 培养基 加入 离心管，接种 细菌悬液 ，在细菌悬液中放入 无菌胃管（扬州市桂龙医疗器械有限公司，型号：），将离心管倾斜 置于摇床，震摇 后，肉眼可见在无菌胃管表面形成菌膜，则提示成功构建细菌生物膜模型。共构建 份生物膜模型，使用随机数字表法将其分为观察组与对照组，各 份。分组后立即进行药物干预，其中观察组采用含浓度为 大叶桉挥发油的培养基 进行培养，对照组用含等量生理盐水的培养基进行培养，分组培养（，培养箱）后取出，在扫描电镜下进行观察。扫描电镜观察前的标本预处理：将 中各组细菌生物膜标本经过 戊二醛固定 ；使用 浸泡清洗 次，次；使用四氧化锇固定 ；使用 浸泡清洗 次，次；依次用、乙醇浸泡脱水（循环 次），次；于通风橱内自然晾干，使用纯六甲基二硅胺烷浸泡 次，次，放入真空干燥器抽真空干燥；将样本粘贴至样本座，使用 离子溅射仪（上海禾早电子科技有限公司，型号：）喷镀后采用扫描电镜观察细菌生物膜形成厚度，分析大叶桉挥发油对细菌生物膜生长的影响。实时荧光定量 检测两组生物膜样本中 表达量 按照上述步骤构建细菌生物膜模型及分组干预后，使用 轻轻润洗胃管，然后用刮刀将胃管内外表面细菌剥离并收集，按照提取试剂盒说明书操作提取样本总。使用反转录试剂盒进行反转录，后获取反转录产物，配制反应体系（、上下游引物各、模板、无菌水）共，使用实时荧光定量 检测仪（上海宏石医疗科技有限公司，型号：）检测。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计并合成，上游引物序列为，下游引物序列为。反应条件：；，循环 次；，。绘制标准曲线，直接利用标准曲线计算出待测样本的具体浓度，结果以 表示。统计学分析采用 及 软件进行统计学分析，计量资料以（）表示，组间比较采用两独立样本 检验，以 表示差异有统计学意义。结 果 大叶桉挥发油的主要有效成分 大叶桉挥发油中存在 种主要成分，分别是 蒎烯、柠檬烯、桉油精、莰烯、邻异丙基苯、松油醇、甲基（甲基乙烯基）环己醇乙酸酯。见图。图 气相色谱质谱分析图谱 大叶桉挥发油抑菌效果 试验结果显示，及以上浓度的大叶桉挥发油具有理想的抑菌效果（见图），因此其 为。药物扩散性检测结果显示，任何浓度的大叶桉挥发油药敏纸片在血平板上均无法观察到抑菌环，见图。图 不同浓度大叶桉挥发油干预铜绿假单胞菌后转接血平板的培养结果 ，图 不同浓度大叶桉挥发油药敏纸片抑菌环 大叶桉挥发油对细菌生物膜生长的影响 对照组已经形成生物膜，其形态较致密，而使用大叶桉挥发油处理过的观察组，其形成的生物膜形态较为疏松，存在多个孔道（图 中红色箭头所指），生物膜形成明显滞后，见图。图 扫描电镜下观察大叶桉挥发油干预铜绿假单胞菌生物膜的效果 细菌生物膜 表达量 绘制标准曲线，得到 ，相关系数 。观察组、对照组的 表达量分别为（）、（），观察组 表达量低于对照组（，）。讨 论 铜绿假单胞菌是导致烧伤创面感染的最常见致病菌。铜绿假单胞菌具有多种生存方式，这是临床上导致感染患者经久不愈的主要原因之一，其主要生存方式之一是形成生物膜。在铜绿假单胞菌生物膜中，胞外多糖纤维或多糖蛋白质复合体纠缠在一起并交错成立体网状，负电荷的藻酸盐弥散于间隙，不仅构成了生物膜的外环境，而且还形成了弥散屏障，阻碍了抗生素的渗透，这使得铜绿假单胞菌的存活能力显著提升。有研究报告，铜绿假单胞菌可利用密度感应系统来调控生物膜的形成，分别是 系统（）和 系统（）。和 分别编码信号分子 氧十二烷酰高丝氨酸内酯和 丁酰高丝氨酸内酯，和 分别编码转录激活蛋白 和 蛋白。已有研究证实，干预、基因表达，可影响铜绿假单胞菌体外形成生物膜的能力，从而在临床治疗铜绿假单胞菌感染方面获得满意的效果。铜绿假单胞菌的生物膜系统，是促使铜绿假单胞菌产生高度耐药性的重要因素，是造成临床顽固性感染的重要原因之一。这促使研究者们开始探索治疗烧伤等各种原因造成的创面铜绿假单胞菌感染的其他途径，如开发新的抗菌药物、基因调控及改进生物医学材料等，但是这些方法尚存在费用高、应用范围窄等问题，限制了临床推广应用。密度感应系统在铜绿假单胞菌生物膜形成过程中起着重要作用。密度感应系统是细菌间通过感知信号分子浓度进行信息传递的一种机制，而细胞密度恰恰是决定信号分子浓度的关键性因素。因此通过干扰密度感应系统，有可能起到降低铜绿假单胞菌耐药性的作用。本研究结果显示，及以上浓度的大叶桉挥发油可充分抑制铜绿假单胞菌的生长，同时可以延缓铜绿假单胞菌生物膜的形成，这提示大叶桉挥发油有着较低的 和较好的杀菌效果。而诸多学者已经发现生物膜的形成与细菌耐药性息息相关，由此可见，大叶桉挥发油抑制细菌生长的机制之一可能是降低其耐药性。本研究结果还显示，大叶桉挥发油可以下调 基因的表达。而研究显示，铜绿假单胞菌许多毒力因子的分泌和生物膜的形成均受到密度感应系统的调控。由此推测大叶桉挥发油不仅具有显著的抑菌作用，在细菌毒力相关系统方面也可发挥抑制作用。综上所述，大叶桉挥发油可直接抑制铜绿假单胞菌的生长，延缓铜绿假单胞菌生物膜的形成以破坏其耐药性，降低铜绿假单胞菌生物膜 基因的表达从而降低其毒力，在临床治疗铜绿假单胞菌感染方面具有较高的应用价值。资源丰富是大叶桉挥发油最大的优势，但其也有不足之处，如制备过程中会散发出刺鼻气味，提取过程需要专业的蒸馏冷凝回收设备，在日常生活中及临床科室无法实现随需随用。因此本课题组将来在更深入地研究其治疗机制的同时，也将针对大叶桉挥发油在日常生活及临床应用中的不足，改进提取、制备和保留方法，发掘并推广其使用价值。（下转第 页）广西医学 年 月第 卷第 期 ，：，（）：，（）：，（）：，：，：，（）：（收稿日期：修回日期：）（上接第 页）参 考 文 献 杨 磊，高兴新，庞远翔，等 烧伤患者感染与 中性粒细胞相关性的初步研究 医学研究生学报，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：曹林忠，尹正国，秦大平，等 脱管散体外抗铜绿假单胞菌生物膜作用的研究 甘肃中医学院学报，（）：，（），：，：，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，（），（）：，（）：，（）：（收稿日期：修回日期：），