Library Construction（14年FIST）by-Dong【公众微信号：bioworlde】.pptx

Epi_Lab 董世华2014.08.23,染色质免疫共沉淀高通量测序文库的构建,（ChIP-Seq）,目录,高通量测序简介；Illumina Solexa原理简介；ChIP Seq 文库构建；,ChIP 回顾,Sanger测序,高通量测序,1 高通量测序简介,高通量测序:一次性对几百万到几十亿条DNA分子进行并行测序，其使得可对一个物种的转录组、基因组以及表观基因组进行深入、细致、全貌的分析，所以又被称为深度测序。High-throughput Sequencing Next Generation Sequencing Deep Sequencing,1 高通量测序简介,1 现有主要高通量测序仪开发商,桥式PCR边合成边测序可逆终止物,2 Illumina Solexa简介,2.1 第一步 文库构建,2.2 第二步 生成簇-桥式PCR,2.2 第二步 生成簇-桥式PCR,2.3 第三步 测序,2.3.1 测序-Read1测序,2.3.1 测序-Read1测序,2.3.2 测序-Index测序,2.3.3 测序-Read 2测序,DNA测序全基因组de novo测序基因组重测序人类外显子组捕获测序RNA测序转录组测序小RNA测序,表观基因组研究DNA甲基化测序ChIP-Seq,读长较短，100150bp；通量高，200-300G每Run；低成本，成熟的流程；,2.4 Solexa 的特点与高通量测序应用范围,染色质免疫共沉淀产物高通量测序文库的构建,ChIP,一、末端补平与纯化二、3加A和纯化 三、加接头 四、胶回收 五、PCR扩增 六、胶回收,第一天8.24,第二天8.25,3.1.1末端补平,利用T4 DNA Polymerase和Klenow DNA polymerase 将DNA的末端补平。补平：轻轻混匀，瞬离。室温（25）30min,加入5倍体积（250ul）buffer PB，轻弹充分混匀，瞬离；转至柱子中，13000rpm离心30s，弃下清。加入750ul buffer PE，13000rpm离心1min,弃下清；再加入500ul buffer PE，再洗涤一次，弃下清；盖上盖子，空转2min；将吸附柱转移到干净的1.5mlEP管中，打开吸附柱盖子，晾干510min。加 44 ul EB（膜中央，但不能戳破膜），静置1 min，13000rpm离心1min，将洗脱下来的液体重新吸到吸附柱中，重复洗脱一次。,3.1.2 纯化,利用Klenow(3-5 exo-)的聚合酶活性在磷酸化的平端DNA的3端加A，得到的DNA可以和3端带有单个T碱基的接头进行连接。3加A：共50ul体系，37 30min。,3.2.1 3加A,注：用MiniElute 柱子（洗脱体积=10ul）加入5倍体积（250ul）buffer PB，轻弹充分混匀，瞬离；转至柱子中，13000rpm离心30s，弃下清。加入750ul buffer PE，13000rpm离心1min,弃下清；再加入500ul buffer PE，再洗涤一次，弃下清；盖上盖子，空转2min；将吸附柱转移到干净的1.5mlEP管中，打开吸附柱盖子，晾干510min。加 18 ul EB（膜中央，但不能戳破膜），静置1 min，13000rpm离心1min，将洗脱下来的液体重新吸到吸附柱中，重复洗脱一次。,3.2.2 纯化,20ul体系，16过夜。,3.3.1 加接头,准备：专用锥形瓶，电泳槽和梳子清洗干净（每次用之前用去离子水洗2遍，用超纯水洗1遍）；120 ml的TAE缓冲液配制2%的agarose(溶解要充分，对着光摇晃没有亮点)，充分混匀、倒板；样品中加入4 ul 6loading buffer，准备100bp，marker与样品间隔点样，防止交叉污染；电泳条件：150V，20min；放在加有EB的TAE缓冲液中浸泡15min；切胶准备：专用的一次性刀片，保鲜膜，1.5ml进口的离心管；切胶：将凝胶成像仪的载物台用纸擦拭干净，铺上保鲜膜，尽量减少凝胶暴露在紫外下的时间，切胶的范围选取200-700bp的片段，记录凝胶在切割前后的照片；称量重量，减去1.5ml EP管重量（1g），计算切胶重量。,3.3.2 配胶、跑胶、切胶,100mg=100ul体积，加入3倍体积的buffer QG，25 1000 rpm 震荡10min溶胶,务必保证胶完全溶解（胶块完全溶解时，溶液为黄色），瞬离。加入切胶样品1倍体积的异丙醇，瞬离，每次取750ul至吸附柱，13000rpm离心30s,直至样品全部过吸附柱。加入500ul Buffer QG，离心30s。加入750ul Buffer PE，离心1min，再一次加入500ul buffer PE洗涤，空转 2min。加 22 ul EB（膜中央，但不能戳破膜），静置1 min，13000rpm离心1min，将洗脱下来的液体重新吸到吸附柱中，重复洗脱一次。,3.3.3 胶回收,这一步是通过PCR扩增上步纯化的DNA，PCR所用的两个引物可以和接头两端退火。30 ul反应体系,3.4.1 PCR扩增,注：用MiniElute 柱子（洗脱体积=10ul）步骤同上次（跑胶150V，40min）。加 22 ul EB（膜中央，但不能戳破膜），静置1 min，13000rpm离心1min，将洗脱下来的液体重新吸到吸附柱中，重复洗脱一次。Qubit 测浓度，跑2100胶测文库片段大小高通量测序！,3.4.2 制胶、跑胶,Qubit 2.0 荧光计,DNA library,RNA library,3.5 小结,2100芯片：检测文库片段长度,读长太短；PCR bias；单细胞基因组、转录组、甲基化谱,3.6 Questions,