从TLR4_NF-κB信号...表口服液抗流感病毒药效机理_杨建树.pdf

，：，（）：，（）：李康梅，戴明明，黎明星，等 基于网络药理学研究淫羊藿治疗多囊卵巢综合征的作用机制 中医药导报，（）：肖卫琼，袁仁智，康开彪 半夏 苍术 香附组药干预痰湿型多囊卵巢综合征的生物机制 中医药导报，（）：，：苏峙宇 基于网络药理学方法探索四物汤治疗多囊卵巢综合征相关机制的研究 锦州医科大学硕士学位论文，丁珊珊，康 洁，黄益清，等 基于网络药理学的二陈汤“异病同治”机制研究 福建中医药，（）：收稿日期：；修订日期：基金项目：国家自然科学基金（）；国家中医药管理局中医药循证能力建设项目（）作者简介：杨建树（），女（汉族），河北张家口人，辽宁中医药大学在读硕士研究生，主要从事中西医临床儿科诊疗与研究工作通讯作者简介：王雪峰（），女（汉族），辽宁沈阳人，辽宁中医药大学附属医院主任医师，教授，博士学位，主要从事中医药干预感染性疾病研究工作从 信号轴探讨小儿解表口服液抗流感病毒药效机理杨建树，王雪峰，蔡 壮（辽宁中医药大学，辽宁 沈阳；辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳）摘要：目的 通过流感病毒滴鼻方法建立甲型 流感病毒模型，从 介导的信号轴探讨小儿解表口服液的治疗作用与其药效机制。方法 流感病毒滴鼻方法建立模型，经给药治疗后，计算各组小鼠肺指数；染色观察肺部组织病理改变；法检测血清中 、含量；法检测、蛋白情况。结果 小儿解表口服液可以较好降低小鼠的肺指数，减轻肺组织损伤；减少 、的含量；降低、蛋白水平（或 ）。结论 小儿解表口服液能有效减轻流感病毒感染后小鼠肺部炎性病变，发生作用的重要途径可能是抑制 信号轴的活化从而发挥减轻炎症的作用。关键词：小儿解表口服液；流感病毒；核转录因子 ；样受体 标识：中图分类号：文献标识码：文章编号：（），（，；，）：（），；、；、；（），：；甲型流感病毒（）是呼吸道病原体，感染人体后严重时可引起肺炎甚至呼吸衰竭，可在全球范围内引起严重的发病率和死亡率。每当到流感高发的季节，儿童的发病率会明显升高。我国的数据显示儿童流感的患病率为 。当流感病毒进入机体内后，会刺激机体的免疫系统，模式识别受体（）则会识别流感病毒的信息物质（如组成蛋白和核酸），最终一起机体免疫反应，介导体内炎症反应。样受体（）是一种跨膜信号传递蛋白，作为重要的细胞内，是机体免疫反应的重要参与者。有研究表明，机体受到外界刺激后，会与相应配体结合，释放 信号轴上相关蛋白，进一步促进下游 、的成熟和释放。在实践中，患儿出现流感时，通常使用一种神经氨酸酶抑制剂，如奥司他韦或扎那米韦治疗，这些抗病毒药物需要尽早服用才能最有效，但是也会出现耐药性，使得药物敏感性 时珍国医国药 年第 卷第 期降低。积极寻找具有替代作用方式的抗病毒药物，有可能提高临床疗效并降低耐药性。小儿解表口服液由“银翘散”化裁而来，其中用到连翘、金银花、蒲公英、葛根、牛蒡子、防风、黄芩、牛黄、荆芥穗等多种中药，具有清热解毒、宣肺解表的功效，针对流感病毒感染期间患儿出现的高热、四肢酸痛、鼻塞、咽干的症状有很好的减轻作用，有明显的抗病毒作用，。因此，本研究以流感病毒感染的小鼠模型为对象，从 信号通路入手，探究不同时间点小儿解表口服液在治疗流感病毒感染小鼠模型中可能发挥的作用机制。材料与仪器 动动物物 级 小鼠 只，周龄，雌雄各半，体质量（），购自辽宁长生公司，许可证为（辽）。饲养于辽宁中医药大学实验中心，通过动物护理和使用委员会批准，并遵循实验动物的护理和使用指南，伦理批号为。病病毒毒、鸡鸡胚胚与与细细胞胞 甲型流感病毒鼠肺适应株 （）由辽宁中医药大学附属医院病毒室提供；级鸡胚 日龄购自辽宁益康公司。试试剂剂与与仪仪器器 小儿解表口服液（生产批号：国药准字，购自威海人生药业公司）；奥司他韦（生产批号：国药准字 购自国大药房）；、检测试剂盒（购买于 公司）；总蛋白提取试剂盒（美国 公司）；试剂盒（碧云天生物科技公司）；、兔单克隆抗体（武汉博士德生物公司）；标记羊抗兔二抗（江苏亲科生物有限公司）；高效 封闭液（英国 公司）；电泳仪（美国 公司）；酶标仪（美国 公司）；凝胶成像（全自动化学发光系统）。方法 模模型型制制备备 各组小鼠在 周适应性饲养之后，用乙醚浸泡过的棉球放置在麻醉罐中，并将所需麻醉小鼠放置于麻醉罐中，处于密封状态。观察到小鼠逐渐出现无力迹象后，立即将其取出，将其肚子向上抓住，并用移液枪将 流感病毒溶液滴到小鼠的鼻孔中，形成流感病毒感染模型，对照组给予相同剂量的生理盐水。分分组组与与给给药药 将 只小鼠随机分为正常组、模型组、小儿解表口服液组、奥司他韦组四组，每组 只。除正常组外，其他组造模成功第 天开始给药，灌胃给与相应的小儿解表口服液，对照组给与奥司他韦，正常组、模型组给同等剂量的生理盐水；持续给药 天。标标本本采采集集 给药后第、天，在禁食 后，对小鼠进行称量，取血，取肺组织，清除血迹，滤纸擦干后把右肺置入无菌离心管，在 冰箱中保存，用于 检测；左肺用 多聚甲醛固定用于后期病理组织切片。计计算算肺肺指指数数检检测测肺肺水水肿肿程程度度 肺水肿的轻重通过肺指数判断。测量完体重后，取下小鼠肺部，盐水清洗，滤纸吸干，称重，然后计算肺指数。肺脏指数 肺重 体重。肺肺组组织织病病理理 染色法观察肺组织病理改变，将肺组织从固定液中取出，脱水、包埋，切片、染色，用显微镜观察。法法检检测测血血清清中中炎炎性性因因子子水水平平 小鼠取眼球血后，在室温下放置，用 离心，放置 冰箱中保存。提取冷冻后的血清，按操作步骤进行酶联免疫吸附试验。首先将标准品配制完成，取出 孔板，分别加入不同浓度标准品，待检样品 分别加入反应孔内，在 下培养。移除每孔液体，加入新鲜稀释工作液 ；孵育 后，加入新鲜稀释工作液 ；在 温箱中孵育 后，加入底物显色工作液，孵育 ，加入终止液，在 下，采用酶标仪测定各组样品的吸光度，并用标准曲线进行浓度测定。蛋蛋白白免免疫疫印印迹迹法法（）检检测测肺肺组组织织中中 、蛋蛋白白的的表表达达 电子天平称取 冻存肺组织，按 总蛋白提取试剂盒的方法，离心 ，将蛋白上清液保存。用 方法对其进行检测，并进行蛋白定量。将蛋白湿转至 膜，用高效封闭液封闭 膜，然后分别加入、蛋白一抗（）在 度冰箱过夜孵育。加入荧光二抗（）在室温下孵育，加入曝光液曝光之后用 软件进行数据分析。统统计计学学方方法法 采用?表示，采用多组对比，数据符合正态分布，方差齐，采用单因素方差分析和 方法进行各组间的对比，为差异具有统计学意义，为显著差异性。结果 小小鼠鼠的的一一般般状状态态 正常组小鼠明显活跃，皮色光滑，有正常饮食，无发热、打喷嚏等表现；模型组小鼠活动明显减少、精神萎靡，皮色灰暗，发热、气促、饮食不佳，出现弓背竖毛表现；给药后，小鼠一般状态较模型组明显减轻，活动和饮食增加，精神状态、打喷嚏、咳嗽症状明显改善，毛发逐渐恢复光泽。各各组组小小鼠鼠肺肺指指数数 较于正常组，模型组小鼠肺指数明显升高（）。与模型组比较，小儿解表口服液组对小鼠肺指数 有 明 显 的 抑 制 作 用，且 具 有 统 计 学 差 异（），表明小儿解表口服液能够改善流感病毒感染后小鼠肺指数。见表。表 各组小鼠肺指数比较（?）组别 天 天 天正常组 模型组 小儿解表口服液组 奥司他韦组 与正常组相比，；与模型组相比，；各各组组小小鼠鼠肺肺病病理理组组织织学学比比较较 正常组肺泡组织形态清楚，无渗出，出血、无炎性细胞，肺泡间隔无增厚；模型组肺泡间隔破裂、变宽，大范围肺泡融合，肺间质水肿，大量炎性细胞聚集；与模型组比较，小儿解表口服液的肺泡结构基本恢复，炎症细胞的浸润和肺泡壁的增厚情况均有所降低。见图。正常组；模型组；小儿解表口服液组；奥司他韦组图 小儿解表口服液对小鼠肺组织病理变化的影响（染色）各各组组小小鼠鼠血血清清中中 、含含量量 较于正常组，模型组小鼠血清中的 、明显升高（）；给药、天后，模型组小鼠血清中 、含量变化趋势一致，均出现显著的上升；小儿解表口服液组与奥司他韦组，随着给药时间的持续，小鼠血清 、均有所降低，其与模型组比较有统计学差异（或 ）。见表。表 小鼠血清中 水平的变化（?）组别 天 天 天正常组 模型组 小儿解表口服液组 奥司他韦组 与正常组比较，；与模型组比较，；时珍国医国药 年第 卷第 期 表 小鼠血清中 水平的变化（?）组别 天 天 天正常组 模型组 小儿解表口服液组 奥司他韦组 与正常组比较，；与模型组比较，；表 小鼠血清中 水平的变（?）组别 天 天 天正常组 模型组 小儿解表口服组 奥司他韦组 与正常组比较，；与模型组比较，；表 小鼠血清中 水平的变化（?）组别 天 天 天正常组 模型组 小儿解表口服液组 奥司他韦组 与正常组比较，；与模型组比较，；各各组组小小鼠鼠肺肺组组织织 、蛋蛋白白的的表表达达 如图 所示，模型组中、蛋白表达量较之正常组均显著增多（）；小儿解表口服液干预治疗之后能下调、蛋白表达，与模型组比较，小儿解表口服液组、蛋白在第、天作用均显著下降（），其中，小儿解表口服液组在治疗、天肺组织中 表达与奥司他韦组相比减弱尤为明显（），表达与奥司他韦组相比有治疗相当的趋势，且具有统计学意义（）。与正常组比较，与模型组比较，图 感染后、蛋白表达 讨论中医对流感病毒感染没有具体定义，但大多数医家根据这一疾病的症状特点和病毒性肺炎的传播规律，将其归类为“风温”，。多数医家认为，外感是风温病外因中最主要的一种病因，而外感中以温热外邪最多，而风温之邪则是最常见的，叶天士首先认识到温邪，而且在其著作温热论认为：“温邪上受，首先犯肺。”病邪袭击人体肌表，循经而上，风热者多从口鼻而入，肺处于高位，必定首先受到侵犯，故本病早期的症状都与手太阴肺经有关系。温热经纬陈平伯外感温病篇中提到的风温提纲：“或恶风，或不恶风，必身热咳嗽，烦渴。”温邪首先犯肺，肺气不利，可以引起发热、喘憋、苔薄、脉浮数等症状，故治疗以清热解毒、疏风散邪为宜。目前已有相关的研究认为，流感病毒侵犯人体时，信号也会被诱导激活。信号通路作为机体的免疫调节通路在病毒性肺炎的发生发展中发挥了重要作用。当宿主被流感病毒感染时，病毒可以诱导一系列信号级联反应，激活表达于巨噬细胞的 分子识别受体，并结合病毒蛋白启动机体的免疫应答。内源性或外源性的刺激使免疫信号信号通路发生信号转导，刺激 的易位，的激活可以诱导下游炎症细胞因子的产生，这些细胞因子在不断的刺激之下，产生自我调节循环并加剧炎症反应。因此，类表面受体的不断表达和激活，促进下游炎症因子的释放是其作用机理之一，等发现，六神丸能通过调控 信号途径的激活，从而进一步抑制甲型流感病毒引起的强烈炎症反应，并使下游相关炎性因子的表达水平降低，起到抗流感病毒的作用。等在探索大黄素对流感病毒的保护作用的基础研究中也发现，大黄素主要是通过抑制流感病毒诱导的、和 的激活，降低肺组织中病毒滴度，减少炎性细胞因子的表达与分泌，进一步改善肺组织病理学变化。图 第 天 感染小鼠肺组织、蛋白表达条带图 第 天 感染小鼠肺组织、蛋白表达条带图 第 天 感染小鼠肺组织、蛋白表达条带从中医角度认为小儿属于“纯阳之体”，很容易受到外界寒热因素的影响，使其临床应用中主要时以甘寒凉的要药物为主，不宜使用辛热、温燥、苦寒等药物。而吴鞠通在温病条辨也认为太阴风温发病时，应该注重用辛凉的药物。小儿解表口服液即是由温病条辨中经典方“银翘散”加减而成，其中用到连翘、金银花、蒲公英、葛根、牛蒡子、防风、黄芩、牛黄、荆芥穗等多种中 时珍国医国药 年第 卷第 期药，具有清热解毒、宣肺解表、豁痰定惊的作用。在现代药理学的研究中显示，小儿解表口服液中的黄芩包含黄芩苷、黄芩素等有效成分，对葡萄球菌、肺炎链球菌、溶血性链球菌等多种病原菌有抑制作用，并可在一定程度上抗炎、抗流感病毒及变态反应；连翘有抗菌、抗氧化的作用；在体内、外的实验研究中也表明连翘也很好的抗流感病毒作用，金银花含有氯原酸、木犀草素等有效成分，有抗炎解热、增强机体免疫功能的作用，荆芥穗有解热镇痛、抗炎、抗病毒的作用，几味药合用，可以起到明显的抗炎、抗病毒的作用。在临床实验的研究中，