苁蓉舒痉颗粒对帕金森病模型大鼠延髓的保护作用_林瑶.pdf

实验研究 福建中医药 2023 年 1 月 第 54 卷 第 1 期Fujian Journal of TCM January 2023，54（1）苁蓉舒痉颗粒对帕金森病模型大鼠延髓的保护作用林瑶1，唐岚芳2，李茜羽3，黄佩珍2，许茜1，王林1，袁明洲1，蔡晶3*（1.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；3.福建中医药大学修园临床医学院，福建 福州 350122）摘要：目的 观察苁蓉舒痉颗粒对帕金森病（PD）模型大鼠延髓的保护作用及机制。方法 将50只健康SD大鼠随机分为对照组10只和造模组40只。造模组大鼠于颈背部皮下注射鱼藤酮葵花油乳化液来建立PD模型，对照组大鼠颈背部皮下注射等体积葵花油。将30只造模成功的大鼠再次随机分为模型组、苁蓉舒痉组、美多芭组各10只，分别予相应药液进行灌胃，连续干预14 d。分别于造模后和干预第7、14天进行网格实验和斜板实验；免疫组化法检测中脑黑质区TH阳性细胞数；TUNEL染色法观察延髓细胞凋亡情况；应用透射电镜观察延髓细胞线粒体形态；Western blot法检测大鼠中脑黑质区-突触核蛋白（-synuclein）和延髓 B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bcl-2相关 X蛋白（Bax）、激活型半胱氨酸蛋白酶 3（cleaved caspase-3）、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）、过氧化物酶体增殖物激活受体-共激活因子-1（PGC-1）的蛋白表达。结果 与对照组比较，模型组大鼠造模后和干预7、14 d后移动潜伏期明显缩短和斜板倾斜角度明显减小（P0.05）；中脑黑质区TH阳性细胞数明显减少（P0.05）；延髓细胞凋亡率明显增加（P0.05），线粒体肿胀；中脑黑质区-synuclein 和延髓cleaved caspase-3、Bax蛋白表达明显提高（P0.05），大鼠延髓Bcl-2、PPAR和PGC-1蛋白明显降低（P0.05）。与模型组比较，苁蓉舒痉组和美多芭组大鼠干预 7、14 d 后移动潜伏期明显延长和斜板倾斜角度明显增大（P0.05）；黑质区TH阳性细胞数明显增加（P0.05）；延髓细胞凋亡率降低（P0.05），线粒体结构接近正常；中脑黑质区-synuclein和延髓cleaved caspase-3、Bax蛋白表达明显降低（P0.05），延髓Bcl-2、PPAR和PGC-1蛋白明显提高（P0.05）。结论 苁蓉舒痉颗粒能减轻PD模型大鼠延髓神经细胞凋亡，这可能与改善PD模型大鼠延髓神经细胞线粒体形态，增加线粒体合成蛋白PPAR及PGC-1表达有关。关键词：帕金森病；苁蓉舒痉颗粒；细胞凋亡；线粒体；PPAR；PGC-1帕金森病（Parkinsons disease，PD）是一种中老年人常见的神经系统退行性疾病，主要临床表现为运动迟缓、静止性震颤、肌强直等，典型的病理变化是中脑黑质区致密部多巴胺能神经细胞的大量变性缺失，临床主要治疗方法是左旋多巴替代疗法。但已有研究表明，当患者出现典型临床症状时，黑质纹状体区域的多巴胺能神经细胞已经丢失60%70%，而左旋多巴替代疗法只补充减少的多巴胺，并不能促进神经细胞存活，故只能减轻症状，并不能延缓病情的进展，且长期使用左旋多巴会出现多种运动并发症1。因此，如果能在神经细胞变性的早期给予神经保护，则可以尽可能地保护更多神经细胞，减少或者延后左旋多巴的使用，达到较好的成本-效益比。苁蓉舒痉颗粒由肉苁蓉、制黄精、丹参、赤芍、牡丹皮等药物按比例浓缩制成，是课题组多年临床经验方。前期临床应用发现其对早期PD患者的运动症状有一定改善作用2，进一步进行动物实验发现其君药肉苁蓉对PD模型大鼠行为学及黑质区多巴胺能神经细胞凋亡均有减轻作用3-4。由于延髓是 PD 发病过程中最早受影响的部位，本实验拟通过观察苁蓉舒痉颗粒对 PD 模型大鼠延髓的影响，为PD的早期神经保护治疗提供实验支持。1实验材料1.1实验动物SPF 级 67 月龄健康雄性 SD 大鼠50只，体质量（20020）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（浙）2019-0002，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2019-0007。饲养于福建中医药大学实验动物中心，温度2022，相对湿度60%65%，光照/黑暗周期为12 h，饮水摄食自由。1.2实验药物苁蓉舒痉颗粒由肉苁蓉 6 g，制黄精12 g，丹参15 g，赤芍12 g，牡丹皮10 g组成，由福建中医药大学附属第三人民医院提供。取苁蓉舒痉颗粒5 g溶于100 mL煮沸的蒸馏水中，配成浓度为 50 mg/mL 的苁蓉舒痉颗粒药液，分装后置于4 冰箱中保存。1.3实验试剂美多芭（上海罗氏制药有限公司，批号：H10930198）；鱼藤酮、葵花油（美国 Sigma 公司，批号：R8875、S5007）；电镜固定液（武汉塞维尔生物科技有限公司，批号：G1102）；酪氨酸羟化酶收稿日期：2021-12-23基金项目：国家自然科学基金青年项目（81804156，81904263）；国家自然科学基金面上项目（82074507）；福建省自然科学基金项目（2018J01882）通信作者：蔡晶，E-mail：DOI：10.13260/ki.jfjtcm.2023.0100410林瑶 等：苁蓉舒痉颗粒对帕金森病模型大鼠延髓的保护作用第 1 期（tyrosine hydroxylase，TH）、-突触核蛋白（-synuclein）、过氧化物酶体增殖物激活受体 （peroxisome proliferator-activated receptor-，PPAR）、过氧化物酶体增殖物激活受体-共激活因子-1（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-，PGC-1）、B 淋巴细胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X，Bax）、激活型半胱氨酸蛋白酶3（cleaved caspase-3）、-actin 抗体（美国 Abcam 公司，批号：ab51134、ab138501、ab178860、ab145641、ab32124、ab32503、ab2302、ab8226）；TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液（北京索莱宝科技有限公司，批号：T2190、PC0020、R0010）；TH免疫组化试剂盒（福建迈新技术有限公司，批号：KIT-9720）；ECL 化学发光检测试剂盒（美国 Bio-RAD公司，批号：1705060）。1.4实验仪器H-7650透射电子显微镜（日本Hitachi公司）；RM2235石蜡切片机、UC6超薄切片机、MDL光学显微镜（德国Leica公司）；ELX800多功能酶标仪（美国Bio-TEK公司）；Universal Hood 化学发光成像仪、PowerPac Basic电泳仪、PowerPac Basic转膜仪（美国 Bio-Rad 公司）；Motic Med 6.0 组织细胞图像分析系统（麦克奥迪实业集团有限公司）。2方法2.1模型建立及评价PD模型制备采用SHERER5创立的经典方法：将鱼藤酮溶于葵花油乳化液，配置终浓度为 1.5 mg/mL的鱼藤酮葵花油乳化液，按1.5 mg/（kg d）于大鼠颈背部进行皮下注射，连续注射14 d。观察大鼠的行为学改变，参照VOITENKO6的行为学评分标准进行评分，28 分者为合格的PD模型大鼠。2.2动物分组及干预将 50 只健康 SD 大鼠随机分为对照组 10 只和造模组 40 只。造模组大鼠按“2.1”项下的造模方法建立PD模型，对照组大鼠于颈背部皮下注射等体积葵花油。造模结束后，行为学评分 1分有 3只，10分有 7只，予剔除，最终造模成功的大鼠共30只。将造模成功的30只大鼠再次随机分为模型组、苁蓉舒痉组、美多芭组，每组各10只。苁蓉舒痉组按 50 mg/（kg d）予苁蓉舒痉药液灌胃，美多芭组按 5 mg/（kg d）予美多芭混悬液灌胃，对照组和模型组予等量生理盐水灌胃，每日灌胃1次，连续灌胃14 d。2.3标本采集灌胃14 d后各组大鼠以20%乌拉坦按5 mL/kg腹腔注射麻醉后取材。各组取3只大鼠心脏灌流后分离中脑黑质与延髓，4%多聚甲醛固定过夜，作石蜡包埋切片，用于免疫组化及TUNEL观察。各组另取3只大鼠冰上迅速剥离延髓，用于超微结构观察。各组剩余4只大鼠，待其完全麻醉后迅速断头取脑，冰盘上分离延髓，用预冷的0.9%氯化钠反复冲洗，除去组织中血液，滤纸吸干，置于-80 冰箱保存，用于蛋白含量检测。2.4观察指标2.4.1行为学检测观察各组大鼠每天进食、饮水、活动、精神情况，并做好记录。分别于造模后和干预第7、14天在同一时间点对各组大鼠进行网格实验和斜板实验。网格实验：将大鼠以倒立姿势置于一个与地面垂直的金属网格（长 80 cm、宽50 cm、格间距1 cm）中央，待其四肢抓牢网格后，开始记录大鼠从静止状态到任意一肢开始活动所需的时间，即为移动潜伏期。每只大鼠重复测3次，每次间隔 5 min。斜板实验：依次将各组大鼠置于覆盖了2 mm厚橡胶垫的平板中央，注意不让大鼠前后肢抓住木板边缘，初始平板与地面夹角为25，当大鼠在该角度的平板上停留时间5 s，斜板向上增加 5；当大鼠在斜板上的静止时间5 s时，记录该倾斜角度。每只大鼠重复测3次，每次间隔5 min。2.4.2免疫组化检测TH阳性细胞数按照试剂盒说明书对上述中脑黑质石蜡切片进行免疫组化染色，200 倍显微镜下观察，以棕黄色或淡黄色颗粒染色为阳性表达。每张切片随机选取5个视野，应用麦克奥迪组织细胞图像系统分析图片，计算 TH阳性反应细胞数。2.4.3TUNEL 检测大鼠延髓细胞凋亡率按试剂盒说明书将各组大鼠延髓石蜡切片进行TUNEL染色，200 倍显微镜下观察大鼠延髓区细胞凋亡情况，TUNEL 阳性细胞核即凋亡细胞核在镜下呈现棕色，正常细胞核为蓝色。每张切片随机选取5个视野统计TUNEL阳性细胞及细胞总数。细胞凋亡率TUNEL阳性细胞/细胞总数100%2.4.4透射电子显微镜观察大鼠延髓线粒体超微结构将修整过的蜡块置于 3%戊二醛固定液中，乙醇梯度脱水，环氧树脂包埋，制作超薄切片，醋酸双氧铀及柠檬酸铅染色，透射电镜下观察延髓线粒体超微结构并摄片。2.4.5Western blot法检测大鼠黑质区及延髓相关蛋白表达取相应脑组织 50 mg，BCA 法测定蛋白浓度。经过蛋白变性、SDS-PAGE电泳、湿转转膜后，5%脱脂牛奶封闭 1 h。加一抗-synuclein（1 1 000）、PPAR（1 1 000）、PGC-1（1 1 000）、Bcl-2（1 1 000）、Bax（1 1 000）、cleaved caspase-3（1 1 000）、-actin（1 2 000），4 摇床过夜。TBST洗涤，加入二抗稀释液（1 5 000），室温孵育2 h，TBST洗涤，ECL显影并成像，Image Lab 4.0 软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值与-actin条带灰度值的比值做为目的蛋白相对表达量。11福建中医药第 54 卷2.5统计学方法采用SPSS 24.0软件进行统计学处理。计量资料符合正态分布以（x s）表示，多组间比较进行单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法或Games-Howell法，检验水准0.05。3结果3.14 组大鼠行为学实验结果比较与对照组比较，模型组大鼠造模后和干预7、14 d后移动潜伏期明显缩短，斜板倾斜角度明显减小（P0.05）；与模型组比较，苁蓉舒痉组和美多芭组大鼠干预7、14 d后移动潜伏期明显延长，斜板倾斜角度明显增大（P0.05）。见表1、表2。3.24组大鼠中脑TH阳性细胞数比较与对照组比较，模型组大鼠黑质区TH阳性细胞数明显降低；经苁蓉舒痉颗粒与美多芭干预后，黑