（打印版）重组蛋白的表达与分离纯化-2014.doc

基因工程重组蛋白的表达与分离纯化 实验目的： 1. 了解基因工程重组表达载体的构建和筛选方法； 2. 掌握重组蛋白诱导表达的机理； 3. 掌握蛋白的分离纯化方法，并学会使用SDS-蛋白质凝胶电泳； 实验原理： 将外源基因克隆在含有lac启动子的pET-30表达载体中，让其在E.coli中表达。先让宿主菌生长，lacI产生的阻遏蛋白与lacI操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录与表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA外源基因大量转录并高效表达。表达蛋白可经SDS-PAGE检测。 实验器材： 1. 仪器：高速冷冻离心机、恒温培养箱、高压灭菌锅、SDS-凝胶电泳仪、水浴锅、抽滤装置、AKTA液相色谱仪等； 2. 材料：LB培养基、溶菌酶、缓冲液A和B、氨苄青霉素、IPTG诱导剂、10%SDS等； 实验内容： 1. 灭菌： ①配置LB培养基20 ml*2 +100 ml*6(配方：酵母粉 0.5%，NaCl 1%，胰蛋白胨1%)； ②黄、蓝枪头各一盒； 2. 菌体活化及扩培： ①每瓶20 ml LB培养基中加入20 ul Amp后，再加入30~40 ul DH5α菌液，置于37℃恒温箱内，培养12~16 h； ②活化后，在六瓶100 ml LB培养基中分别加入100 ul Amp后，再从20 ml活化后的菌液中取2 ml，置于37℃恒温箱内扩大培养，至少培养2.5 h以后加入IPTG 200ul，37℃，培养14~16h； 3. 细胞破碎及蛋白分离： ①将菌液用大离心管收集，配平后，4000r/min，离心15 min，收集菌体； ②用20 ml BufferA重悬菌体，4000r/min，再离心15 min，收集菌体； ③用4 ml BufferA重悬菌体，加入溶菌酶40 ul混匀，静置15min； ④再加入4 ml BufferB，混匀，75℃水浴保温1 h； ⑤用高速冷冻离心机在4℃的条件下，8000r/min，离心20 min，收集上清液； ⑥将上清液分装入几个浓缩管中，4℃，3000r/min浓缩一段时间至终体积为5-10ml，做好标记，备用； ⑦实验过程中，配置五种AKTA液相色谱仪所需液体，并抽滤2遍； 4. AKTA液相色谱分析及SDS凝胶电泳： ①首先学习AKTA仪器的相关使用方法和注意事项，对仪器进行排气，平衡缓冲液冲洗等操作(该部分由老师操作演示)； ②取5 ml浓缩后的液体过滤后上样，观察屏幕上紫外吸收曲线的变化，适时用离心管收集每个峰的样品，做好标号，备用。将变化曲线保存，实验结束后分析曲线； ③配置SDS凝胶电泳所需的浓缩胶和分离胶，处理Loading Buffer，将Marker和存样(纯化前 上清液、纯化后的各个峰收集液)上样跑电泳。最后，将胶染色脱色，照相保存； 实验要求： 1、 各组同学可尝试分析本次实验纯化获得的目的蛋白是胞内蛋白还是胞外蛋白？如何通过实验进行验证？； 2、 保留分离过程每一步样品，最后进行蛋白电泳分析过程中现象，及讨论过程中出现的问题； 3、 各组谱图之间进行比较的分析、讨论，找出实验中问题并试图提出解决方案。 4、 按照研究论文格式写一份研究报告，内容包括：中英文摘要、前言、实验材料和方法、实验结果与讨论、结论。重点是讨论部分，与其他组结果进行比较和分析，最后得出结论。 思考题： 1. 简述如何构建基因重组菌及重组菌的筛选； 2. 简述AKTA液相色谱仪的基本操作流程； 3. 阐述阴离子交换柱是如何完成蛋白质的分离纯化；