总评归一-响应面法优化米槁叶多糖的提取工艺_魏晴.pdf

，化学与生物工程 基金项目：贵州省科技计划项目（黔科合基础 一般 ），国家自然科学基金委贵州省人民政府联合基金项目子课题（），贵州省中医药管理局项目（，），贵州省教育厅青年人才项目（黔教合 字 ）收稿日期：作者简介：魏晴（），女，黑龙江齐齐哈尔人，讲师，研究方向：中药药效物质基础及作用机理，：。：魏晴，何兰凤，郑双，等 总评归一响应面法优化米槁叶多糖的提取工艺 化学与生物工程，（）：，（）：，总评归一响应面法优化米槁叶多糖的提取工艺魏晴，何兰凤，郑双，梁珊珊，孙庆文（贵州中医药大学药学院，贵州 贵阳 ；贵州中医药大学 大果木姜子研究中心，贵州 贵阳 ；贵州中医药大学 植物多糖研究中心，贵州 贵阳 ）摘要：以米槁叶得膏率、多糖含量和抗氧化活性为评价指标，在单因素实验的基础上，采用总评归一响应面法优化了米槁叶多糖的提取工艺。确定最佳提取工艺为：提取时间 、提取功率 、液料比（），在此条件下，总评归一值（）为 ，米槁叶多糖含量为。关键词：米槁叶；多糖；总评归一响应面法；超声提取中图分类号：，（.，；.，；.，）：，：，（），（），：；米 槁（）为 樟 科（）樟属（）常绿乔木。大果木姜子为米槁的干燥成熟果实，是贵州苗族民间常用药物，最早收录于 本草纲目拾遗。大果木姜子具有驱散、疏通中焦寒气而止痛的作用，临床常用来治疗因寒邪阻滞而引起的胸腹部疼痛。但大果木姜子产量魏晴，等：总评归一响应面法优化米槁叶多糖的提取工艺 年第期 低、体积小、不易采摘。目前对米槁果实的化学成分和药理学研究比较深入，但对米槁其它部位如叶、种子等的研究较少。多糖与蛋白质功能相似，作为生命活动中不可缺少的大分子，在免疫系统中起着重要的作用。传统的多糖提取工艺存在耗时长、溶剂用量大、工艺复杂等缺点，不利于大规模生产。因此，需要开发一种操作简单、高效的多糖提取工艺。由于单一评价指标不足以全面反映多糖提取工艺的优化结果，故选取多个指标综合评价多糖提取工艺。作者以米槁叶为研究对象，以米槁叶得膏率、多糖含量和抗氧化活性为评价指标，在单因素实验的基础上，采用总评归一响应面法优化米槁叶多糖的提取工艺，为米槁叶的开发应用提供理论基础。实验材料、试剂与仪器米槁叶，采摘于贵州省罗甸县，经贵州中医药大学药学院孙庆文教授鉴定为米槁（）的叶。葡萄糖标准品（纯度，批号 ），大连美仑生物技术有限公司；（，二苯基三硝基苯肼，纯度），美国 公司；苯酚、无水乙醇，分析纯，西陇科学。型紫外可见分光光度计，上海赫尔普仪器有限公司；型超声波清洗仪，青岛精诚仪器仪表有限公司。米槁叶的前处理取新鲜的米槁叶，除去多余的枝梗和杂质，置于室内通风处阴干后，粉碎，过 目筛，得到米槁叶粉末。米槁叶多糖提取工艺的优化以得膏率、多糖含量和抗氧化活性等个指标对米槁叶多糖提取工艺进行综合评价。采用 法归一化处理得膏率、多糖含量、抗氧化活性这个指标，所有指标最终通过总评归一值（）进行评价。单因素实验采用单因素实验，分别考察提取时间（、）、提取功率（、）、液料比（、，下同）、提取次数（、）、提取温度（、）对米槁叶得膏率、多糖含量、抗氧化活性的影响。响应面实验在单因素实验的基础上，选取提取时间、提取功率、液料比为考察因素，以 值为评价指标，设计响应面实验，进一步优化米槁叶多糖的提取工艺。检测方法得膏率的测定参照文献 方法测定得膏率。将洁净蒸发皿置于 恒温干燥箱中干燥至恒重（），精密量取提取液，置于蒸发皿中水浴蒸干，再于 干燥至恒重，冷却 后，迅速精密称重（）。按式（）计算得膏率：得膏率（）（）式中：为提取液体积，；为米槁叶粉末样品质量，。多糖含量的测定参照文献 方法绘制葡萄糖标准曲线。精密称取葡萄糖标准品 ，置于 恒温干燥箱中干燥至恒重，移入 容量瓶中，加蒸馏水溶解并定容，得到 的葡萄糖标准母液；然后将标准母液依次稀释得到 、的标准溶液。分别取各浓度标准溶液，加入苯酚溶液，混匀，再迅速加入浓硫酸，摇匀后冷却至室温，以蒸馏水作为空白对照，测定 处吸光度。以葡萄糖浓度（）为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，拟合得到线性回归方程为：.，.。参照文献 方法测定米槁叶多糖含量。取提取液，加入蒸馏水、苯酚溶液，摇匀，迅速加入浓硫酸，摇匀后冷却至室温，测定其吸光度。根据标准曲线回归方程计算提取液中的多糖含量，按式（）计算多糖含量：多糖含量 （）式中：为提取液中的多糖含量，；为稀释倍数；为提取液体积，；为米槁叶粉末样品质量，。抗氧化活性的测定通过测定米槁叶多糖对 自由基的清除率评价其抗氧化活性。参照文献 方法，取提取液，加入 自由基工作液，摇匀，避光静置 ，测定 处吸光度，平行测定次，取平均值。按式（）计算 自由基清除率：自由基清除率（）（）式中：为 自由基工作液的吸光度；魏晴，等：总评归一响应面法优化米槁叶多糖的提取工艺 年第期 为提取液 自由基工作液的吸光度；为提取液的吸光度。结果与讨论单因素实验结果提取时间的影响（表）表 提取时间对米槁叶得膏率、多糖含量和抗氧化活性的影响 ，提取时间 得膏率多糖含量 自由基清除率 值 注：提取功率、液料比、提取次数次、提取温度。由表可知，随着提取时间的延长，得膏率、多糖含量、自由基清除率均逐渐升高；当提取时间为 时，各指标达到最高；当提取时间继续延长至 时，各指标略有下降。可能是由于，提取时间过长，米槁叶中其它成分被提取出来，导致多糖占比降低、抗氧化活性下降。因此，提取时间选择 较为适宜。提取功率的影响（表）表提取功率对米槁叶得膏率、多糖含量和抗氧化活性的影响 ，提取功率得膏率多糖含量 自由基清除率 值 注：液料比、提取时间 、提取次数次、提取温度。由表可知，随着提取功率的增大，得膏率、多糖含量、自由基清除率均逐渐升高；当提取功率为 时，各指标达到最高；当提取功率继续增大至 后，各指标略有下降。可能是由于，提取功率过大，多糖结构被破坏，导致多糖含量下降、抗氧化活性降低。因此，提取功率选择 较为适宜。液料比的影响（表）表液料比对米槁叶得膏率、多糖含量和抗氧化活性的影响 ，液料比得膏率多糖含量 自由基清除率 值 注：提取功率、提取时间 、提取次数次、提取温度。由表可知，随着液料比的增大，即提取溶剂用量的增加，得膏率、多糖含量、自由基清除率均逐渐升高；当液料比为 时，各指标达到最高；当液料比继续增大至 后，各指标略有下降。可能是由于，提取溶剂用量过多，更多其它成分被溶出，导致多糖含量下降、抗氧化活性降低。因此，液料比选择 较为适宜。提取次数的影响（表）表 提取次数对米槁叶得膏率、多糖含量和抗氧化活性的影响 ，提取次数次得膏率多糖含量 自由基清除率 值 注：液料比、提取功率、提取时间 、提取温度。由表可知，随着提取次数的增加，得膏率略有升高，多糖含量、抗氧化活性先略微升高而后降低，总体变化不大。综合考虑，提取次数选择次较为适宜。提取温度的影响（表）由表可知，随着提取温度的升高，得膏率、多糖含量、自由基清除率均逐渐升高；当提取温度为 时，各指标达到最高；当提取温度继续升至 后，各指标均明显 下降。因此，提取温度选择 较为适宜。魏晴，等：总评归一响应面法优化米槁叶多糖的提取工艺 年第期 表 提取温度对米槁叶得膏率、多糖含量和抗氧化活性的影响 ，提取温度得膏率多糖含量 自由基清除率 值 注：提取功率、液料比、提取时间 、提取次数次。响应面实验结果响应面实验设计与结果响应面实验的因素与水平见表，设计与结果见表。表响应面实验的因素与水平 水平因素 提取时间 提取功率 液料比（）表响应面实验设计与结果 序号得膏率 多糖含量 自由基清除率 值 回归模型的建立与方差分析对实验结果进行拟合，得到回归方程为：值 .（.）（.）.。对回归模型进行方差分析，结果见表。表方差分析 方差来源平方和自由度均方值值显著性模型 残差 失拟项 绝对误差 总差 注：表示，差异显著；表示，差异极显著。由表可知，模型的.，差异有统计学意义；失拟项.，.，不显著，说明该模型拟合度较好。一次项、，二次项，交互项、对 值的影响极显著。进一步比较值可知，各因素对米槁叶多糖提取的影响大小顺序为：提取功率（）液料比（）提取时间（）。响应面分析各因素交互作用对 值影响的响应面图及等高线图见图。由图可知，提取功率与液料比的响应曲面较陡，且等高线呈椭圆，说明两者交互作用对 值影响较大，与方差分析结果一致。由方程得到米槁叶多糖的最佳提取工艺为：提取时间 、提取功率 、液料比 ，在此条件下，值为 。工艺验证考虑到实际可操作性，将米槁叶多糖的最佳提取工艺调整为：提取时间 、提取功率 、液料比。在此条件下进行次平行验证实验，平均值为 ，与预测值（）的相对偏差为，米槁叶多糖含量为。说明该模型预测魏晴，等：总评归一响应面法优化米槁叶多糖的提取工艺 年第期 图各因素交互作用对 值影响的响应面图及等高线图 性较好，多指标评价优化的米槁叶多糖提取工艺可行。结论以米槁叶得膏率、多糖含量和抗氧化活性为评价指标，在单因素实验的基础上，采用总评归一响应面法优化了米槁叶多糖的提取工艺。确定最佳提取工艺为：提取时间 、提取功率 、液料比（），在此条件下，值为 ，米槁叶多糖含量为。该研究为开发米槁新的药用部位提供了理论依据。参考文献：贵州省药品监督管理局贵州省中药材、民族药材质量标准贵阳：贵州科技出版社，：王军才，刘济明，文爱华，等贵州省苗药植物大果木姜子的研究进展黑龙江农业科学，（）：，（）：刘杰，郭江涛大果木姜子挥发油的研究进展化学工程师，（）：，（）：李建银，许建阳，邱德文苗药大果木姜子的化学和药理学研究进展 全国苗医药学术研讨会特辑，：，：，：，（），：，：李静，樊佳妮，张龄芷，等活性植物多糖在食品领域的应用综述上海师范大学学报（自然科学版），（）：，（），（）：，：何佩娟，张宇洁 多糖含量测定的方法综述 现代食品，（）：，（）：（下转第 页）李婷，等：秦岭特色药用植物桃儿七内生真菌代谢产物的分离鉴定及生物活性研究 年第期 ：，：，（）：，：，（）：，：，：，（）：，（）：，（）：，（），（）：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，？，（）：（上接第 页）牛晓静，鲁静，马彦江，等 基于多指标总评归一法优选槐角炮制工艺中华中医药学刊，（）：，（）：，：，：，：蒋腾川，王艳林，洪影雯，等 不同生长年限对三七主根中总皂苷及浸出物含量的影响广西中医药，（）：，（）：罗素菜，张海江王不留行药材中多糖含量测定研究亚太传统医药，（）：，（）：方杰，王成祥，王莉婷，等红曲茯苓片中多糖含量测定方法的比较研究时珍国医国药，（）：，（）：张雨曦，曾丹菊花三七胶囊及其功效成分对半乳糖衰老模型小鼠的抗氧化作用研究食品安全质量检测学报，（）：，（）：