阻断连接子蛋白43(Cx4...64.7巨噬细胞M1型极化_蒋涵.pdf

论论著著文文章章编编号号：（）阻阻断断连连接接子子蛋蛋白白 （）抑抑制制脂脂多多糖糖诱诱导导的的小小鼠鼠 巨巨噬噬细细胞胞 型型极极化化蒋蒋涵涵，王王璐璐，张张莹莹莹莹，何何文文君君，闫闫美美娟娟，单单莉莉娅娅，李李新新芝芝，马马克克涛涛，（石石河河子子大大学学医医学学院院：新新疆疆地地方方与与民民族族高高发发病病教教育育部部重重点点实实验验室室，病病理理生生理理学学教教研研室室，新新疆疆 石石河河子子 ；绵绵阳阳市市中中心心医医院院，四四川川 绵绵阳阳 ；石石河河子子大大学学医医学学院院生生理理学学教教研研室室，新新疆疆 石石河河子子 ）收收稿稿日日期期：；接接受受日日期期：基基金金项项目目：国国家家自自然然科科学学基基金金（）；绵绵阳阳市市中中心心医医院院孵孵化化课课题题（）作作者者简简介介：蒋蒋涵涵（），女女，重重庆庆市市人人，硕硕士士研研究究生生 ：；：通通讯讯作作者者，马马克克涛涛，：；李李新新芝芝，：摘摘 要要 目目的的 研研讨讨连连接接子子蛋蛋白白 （）在在脂脂多多糖糖（）诱诱导导的的小小鼠鼠 巨巨噬噬细细胞胞 型型极极化化中中的的作作用用。方方法法 将将体体外外培培养养的的小小鼠鼠 巨巨噬噬细细胞胞分分为为对对照照组组、组组、联联合合 阻阻断断剂剂模模拟拟肽肽 （）或或模模拟拟肽肽 （）预预处处理理组组（联联合合 组组、联联合合 组组）。法法检检测测小小鼠鼠 巨巨噬噬细细胞胞 和和 型型极极化化标标志志物物 、诱诱导导型型一一氧氧化化氮氮合合酶酶（）的的蛋蛋白白水水平平，免免疫疫荧荧光光细细胞胞化化学学染染色色观观察察 在在 巨巨噬噬细细胞胞的的表表达达和和定定位位，流流式式细细胞胞术术检检测测小小鼠鼠 巨巨噬噬细细胞胞 型型极极化化标标志志物物 的的表表达达频频数数。结结果果 与与对对照照组组相相比比，组组中中 、和和 的的蛋蛋白白表表达达明明显显升升高高，的的表表达达频频数数明明显显升升高高；与与 组组相相比比，在在 联联合合 组组和和 联联合合 组组中中 和和 的的蛋蛋白白表表达达均均显显著著降降低低，的的表表达达频频数数均均显显著著降降低低。因因此此，可可以以诱诱导导小小鼠鼠 巨巨噬噬细细胞胞向向 型型极极化化，而而 和和 能能够够降降低低 型型极极化化标标志志物物的的表表达达。结结论论 通通过过阻阻断断 可可以以抑抑制制巨巨噬噬细细胞胞 型型极极化化。关关键键词词 脂脂多多糖糖（）；巨巨噬噬细细胞胞；极极化化；连连接接子子蛋蛋白白 （）中中图图分分类类号号 ，文文献献标标志志码码 ，；，；，；，：；（）（）：，（），；（）细胞与分子免疫学杂志（），（）DOI:10.13423/ki.cjcmi.009472 动动脉脉粥粥样样硬硬化化（，）是是一一种种以以免免疫疫活活动动为为特特征征的的慢慢性性炎炎症症性性血血管管疾疾病病，特特征征是是血血管管壁壁进进行行性性增增厚厚，是是心心血血管管疾疾病病致致死死的的主主要要原原因因之之一一 。主主要要病病理理过过程程为为多多种种因因素素（炎炎症症、血血流流剪剪切切力力、高高血血压压）引引起起的的血血管管内内皮皮细细胞胞受受损损，低低密密度度脂脂蛋蛋白白与与内内皮皮细细胞胞结结合合后后进进入入内内皮皮下下间间隙隙，经经氧氧化化修修饰饰被被巨巨噬噬细细胞胞清清道道夫夫受受体体识识别别并并快快速速摄摄取取，诱诱使使巨巨噬噬细细胞胞转转变变为为泡泡沫沫细细胞胞并并大大量量聚聚集集、坏坏死死形形成成细细胞胞外外脂脂质质核核心心，随随后后动动脉脉中中膜膜的的平平滑滑肌肌细细胞胞迁迁入入内内膜膜并并大大量量增增生生，最最终终演演变变为为纤纤维维斑斑块块 。在在动动脉脉粥粥样样硬硬化化斑斑块块破破裂裂期期，型型巨巨噬噬细细胞胞大大量量浸浸润润，炎炎症症因因子子分分泌泌增增加加 ，型型巨巨噬噬细细胞胞的的数数量量逐逐渐渐上上升升并并占占主主要要地地位位，进进而而可可能能引引发发较较严严重重的的急急性性动动脉脉粥粥样样硬硬化化血血管管意意外外 。脂脂多多糖糖（，）是是 阴阴性性菌菌细细胞胞壁壁外外壁壁的的重重要要组组成成成成分分，是是炎炎症症和和巨巨噬噬细细胞胞 型型极极化化的的强强诱诱导导剂剂之之一一 。型型巨巨噬噬细细胞胞能能够够介介导导炎炎症症 反反 应应 并并 引引 起起 型型 辅辅 助助 （，）细细胞胞型型免免疫疫应应答答，分分泌泌促促炎炎因因子子和和相相关关介介质质 。经经 诱诱导导的的 型型巨巨噬噬细细胞胞的的标标志志分分子子主主要要有有诱诱导导型型一一氧氧化化氮氮合合酶酶（，）、肿肿瘤瘤坏坏死死因因子子 （，）等等 。研研究究发发现现，巨巨噬噬细细胞胞中中广广泛泛表表达达各各种种连连接接子子蛋蛋白白（，），包包含含 、等等，其其中中 的的表表达达最最为为丰丰富富。在在巨巨噬噬细细胞胞中中的的各各种种作作用用包包括括迁迁移移、抗抗原原呈呈现现和和某某些些细细胞胞间间通通讯讯形形式式，以以及及更更精精细细的的过过程程，如如在在心心跳跳传传播播中中的的电电化化学学支支持持，肺肺中中的的免免疫疫调调节节和和巨巨噬噬细细胞胞分分化化。连连接接子子蛋蛋白白构构成成的的缝缝隙隙连连接接通通道道还还能能参参与与多多种种免免疫疫调调节节过过程程 。有有研研究究报报道道在在 和和 干干扰扰素素（，）联联合合刺刺激激小小鼠鼠 巨巨噬噬细细胞胞后后，细细胞胞 表表达达上上调调，而而应应用用非非特特异异性性缝缝隙隙连连接接阻阻断断剂剂 甘甘草草次次酸酸干干预预后后，单单核核 巨巨噬噬细细胞胞穿穿越越血血脑脑屏屏障障模模型型的的能能力力下下降降以以及及基基质质金金属属蛋蛋白白酶酶 （，）的的释释放放减减少少 。提提示示通通过过调调节节 的的表表达达高高低低，可可以以进进一一步步调调节节疾疾病病的的发发展展进进程程。在在小小鼠鼠脑脑灰灰质质星星形形胶胶质质细细胞胞瘤瘤中中，特特异异性性敲敲低低 可可减减轻轻脊脊髓髓炎炎性性脱脱髓髓鞘鞘 。有有多多种种与与其其对对应应的的阻阻断断剂剂，其其中中模模拟拟肽肽 、是是 半半通通道道特特异异性性阻阻断断剂剂 ，可可以以通通过过泛泛素素 蛋蛋白白酶酶途途径径减减少少 的的表表达达量量，进进一一步步调调节节疾疾病病的的发发展展。通通过过对对巨巨噬噬细细胞胞 型型极极化化过过程程进进行行调调节节，从从而而改改善善 等等相相关关疾疾病病的的状状况况，是是对对相相关关疾疾病病进进行行免免疫疫调调节节的的作作用用机机制制之之一一 。而而关关于于 对对 诱诱导导的的小小鼠鼠 巨巨噬噬细细胞胞 型型极极化化的的影影响响的的相相关关研研究究还还未未见见报报道道。本本实实验验拟拟通通过过体体外外细细胞胞实实验验，初初步步研研讨讨 特特异异性性阻阻断断剂剂 和和 对对 处处理理后后小小鼠鼠 巨巨噬噬细细胞胞 型型极极化化的的影影响响，探探讨讨 在在小小鼠鼠 巨巨噬噬细细胞胞 型型极极化化中中的的作作用用，进进而而为为 等等相相关关疾疾病病的的治治疗疗提提供供新新的的思思路路和和方方法法。材材料料和和方方法法 材材料料小小鼠鼠 巨巨噬噬细细胞胞购购自自中中科科院院上上海海细细胞胞库库，由由新新疆疆地地方方和和民民族族高高发发病病教教育育部部重重点点实实验验室室冻冻存存；、碘碘化化丙丙啶啶（，）、牛牛血血清清白白蛋蛋白白（，）购购自自 公公司司；培培养养基基、青青霉霉素素和和链链霉霉素素购购自自 公公司司；胰胰蛋蛋白白酶酶购购自自 公公司司；胎胎牛牛血血清清（，）购购自自 公公司司；小小鼠鼠抗抗 单单克克隆隆抗抗体体、兔兔抗抗 抗抗体体、兔兔抗抗 抗抗体体、兔兔抗抗 抗抗体体均均购购自自 公公司司；藻藻红红蛋蛋白白（，）标标记记的的抗抗 抗抗体体（）流流式式抗抗体体购购自自 公公 司司；（氨氨 基基 酸酸 序序 列列 为为 ，分分子子式式为为 ）和和 （氨氨基基酸酸序序列列为为 ，分分子子式式为为 ）购购自自 公公司司；小小鼠鼠抗抗 抗抗体体、异异硫硫氰氰酸酸荧荧光光素素（，）标标记记的的山山羊羊抗抗兔兔 和和辣辣根根过过氧氧化化物物酶酶（，）标标记记的的山山羊羊抗抗小小鼠鼠 、标标记记的的山山羊羊抗抗兔兔 均均购购自自北北京京中中杉杉金金桥桥生生物物技技术术有有限限公公司司；二二辛辛可可宁宁酸酸（，）法法蛋蛋白白质质定定量量试试剂剂盒盒购购自自 公公司司；其其余余试试剂剂均均为为国国产产分分析析纯纯。高高速速低低温温离离心心机机购购自自 公公司司；台台式式低低速速离离心心机机购购自自湖湖南南可可成成仪仪器器设设备备有有限限公公司司；恒恒温温细细胞胞培培养养箱箱购购自自上上海海力力申申科科学学仪仪器器有有限限公公司司；电电泳泳槽槽、电电转转仪仪购购自自北北京京市市六六一一仪仪器器厂厂；流流式式细细胞胞仪仪购购自自 公公司司；激激光光共共聚聚焦焦显显微微镜镜购购自自 公公司司。方方法法 小小鼠鼠 巨巨噬噬细细胞胞培培养养及及实实验验分分组组小小鼠鼠 巨巨噬噬细细胞胞培培养养于于含含有有 的的 完完全全培培养养基基中中，细细胞胞置置于于 ，湿湿度度下下，在在 的的培培养养箱箱中中传传代代培培养养。取取对对数数生生长长期期的的细细胞胞进进行行实实验验，将将小小鼠鼠 巨巨噬噬细细胞胞分分为为对对照照组组、处处理理组组、联联合合 组组、联联合合 组组。其其中中 组组给给予予 作作 用用 ，联联 合合 组组 先先 给给 予予 预预处处理理 ，再再给给予予 作作用用 ；联联合合 组组先先给给予予 期 蒋涵，等 阻断连接子蛋白（）抑制脂多糖诱导的小鼠 巨噬细胞 型极化 预预处处理理 ，再再给给予予 作作用用 。法法检检测测小小鼠鼠 巨巨噬噬细细胞胞 、的的 蛋蛋 白白 表表 达达 将将 小小 鼠鼠 巨巨噬噬细细胞胞分分为为对对照照组组、处处理理组组、联联合合 组组、联联合合 组组。其其中中 组组给给予予 作作用用 ，联联合合 组组先先给给予予 预预处处理理 ，再再给给予予 作作用用 ；联联合合 组组先先给给予予 预预处处理理 ，再再给给予予 作作用用 。取取出出已已干干预预好好的的细细胞胞，细细胞胞刮刮刀刀均均匀匀刮刮落落贴贴壁壁细细胞胞，离离心心 。采采用用 法法测测定定蛋蛋白白浓浓度度后后，取取蛋蛋白白样样品品加加入入适适量量的的上上样样缓缓冲冲液液，置置于于沸沸水水中中使使蛋蛋白白变变性性，分分离离。电电泳泳完完毕毕后后，将将凝凝胶胶上上的的蛋蛋白白转转移移至至 膜膜上上，置置于于含含 脱脱脂脂奶奶粉粉的的 缓缓冲冲液液中中室室温温封封闭闭 。分分别别加加入入 稀稀释释的的兔兔抗抗 抗抗体体、兔兔抗抗 抗抗体体、兔兔抗抗 抗抗体体、小小鼠鼠抗抗 单单克克隆隆抗抗体体，过过夜夜，洗洗膜膜后后，再再加加入入 稀稀释释的的 标标记记的的山山羊羊抗抗小小鼠鼠 或或 标标记记的的山山羊羊抗抗兔兔 ，室室温温摇摇床床孵孵育育 ；洗洗膜膜 次次，发发光光试试剂剂显显影影、压压片片、曝曝光光。采采集集图图像像后后，应应用用 软软件件进进行行分分析析。免免 疫疫 荧荧 光光 细细 胞胞 化化 学学 染染 色色 法法 检检 测测 小小 鼠鼠 巨巨噬噬细细胞胞 表表达达 分分组组和和处处理理情情况况同同上上。从从 培培养养箱箱取取出出处处理理后后的的细细胞胞，弃弃培培养养基基，用用预预温温的的 洗洗 次次。多多聚聚甲甲醛醛固固定定细细胞胞 ，洗洗 次次；用用 于于 恒恒温温封封闭闭 ，弃弃封封闭闭液液，洗洗 次次；分分别别加加入入小小鼠鼠抗抗 抗抗体体（）、兔兔抗抗 抗抗体体（），置置于于湿湿盒盒内内 过过夜夜；洗洗涤涤后后，滴滴加加 标标记记的的山山羊羊抗抗兔兔 （），暗暗室室恒恒温温孵孵育育 ；染染核核 ，洗洗 次次；抗抗荧荧光光衰衰减减封封片片剂剂封封片片，激激光光共共聚聚焦焦显显微微镜镜下下观观察察并并采采像像。图图像像采采集集后后使使用用 软软件件进进行行分分析析。流流式式细细胞胞术术检检测测小小鼠鼠 巨巨噬噬细细胞胞膜膜表表面面标标志志物物 的的表表达达 分分组组和和处处理理情情况况