大黄对二乙基亚硝胺致大鼠肝癌癌前损伤作用及机制_程金妞.pdf

14第25 卷 第 1 期 2023 年 1 月辽 宁 中 医 药 大 学 学 报JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCMVol.25 No.1 Jan.，2023大黄对二乙基亚硝胺致大鼠肝癌癌前损伤作用及机制程金妞1，刘真真1，齐晓茹1，孙思语1，刘晓梅1，赵安妮1，那莎1，刘岩岩1，李璐1，2（1.安徽中医药大学，安徽 合肥 230012；2.安徽省中医药科学院中西医结合研究所，安徽 合肥 230012）基金项目：国家自然科学基金项目（81703826）；安徽省自然科学基金项目（1808085MH301）作者简介：程金妞（1997-），女，河南信阳人，硕士在读，研究方向：中西医结合基础。通讯作者：李璐（1979-），女，安徽马鞍山人，教授，博士，研究方向：中西医结合基础。E-mail：。摘要：目的 探讨大黄（Rhubarb）对二乙基亚硝胺致大鼠肝癌癌前损伤的作用及机制。方法 将SD大鼠分为正常对照组、大黄处理组、DEN处理组和大黄+DEN处理组4组。采用酶活性检测谷丙转氨酶（SGPT）活性、HE染色观察各组肝组织病理变化、Western blot法检测细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，Erk1/2）、细胞外调节蛋白激酶磷酸化（p-Erk1/2）、缺氧诱导因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）、丙酮酸激酶同工酶M2型（pyruvate kinase M2，PKM2）等蛋白的表达。结果 与正常对照组、大黄处理组、DEN处理组相比，大黄+DEN组血清SGPT活性显著升高。病理切片HE染色显示，正常对照组大鼠和大黄处理组大鼠的肝细胞形态正常。DEN处理组的大鼠中，肝细胞排列紊乱并呈玻璃体样病变。与DEN处理大鼠相比，大黄+DEN处理的大鼠肝组织病理学变化更严重。Western blot结果表明与其他组相比，大黄+DEN组大鼠肝组织中Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1、PKM2等蛋白水平显著升高。使用白藜芦醇作为PKM2的抑制剂，Westrn blot结果显示，与大黄+DEN处理2组相比，白藜芦醇+大黄+DEN处理组大鼠肝组织中PKM2蛋白水平显著降低；HE染色结果表明白藜芦醇减弱了大黄联合DEN对肝损伤的促进作用。结论 单独使用大黄对肝脏无损害，但大黄与DEN联合使用可促进大鼠的肝损伤，这与PKM2介导的有氧糖酵解有关。关键词：大黄；二乙基亚硝胺；肝毒性；丙酮酸激酶同工酶M2型；有氧糖酵解中图分类号：R735.7 文献标志码：A 文章编号：1673-842X (2023)01-0014-06Effect and Mechanism of Dahuang（Rhei Radix Et Rhizoma）on Promoting Diethylnitrosamine to Hepatic Precancerous Injury in the RatsCHENG Jinniu1，LIU Zhenzhen1，QI Xiaoru1，SUN Siyu1，LIU Xiaomei1，ZHAO Anni1，NA Sa1，LI Yanyan1，LI Lu1，2（1.Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230012，Anhui，China；2.Institute of Integrated Chinese and Western Medicine，Anhui Academy of Chinese Medicine，Hefei 230012，Anhui，China）Abstract：Objective To investigate the effect and mechanism of Dahuang（Rhei Radix Et Rhizoma）on prehepatic carcinoma injury of diethylnitrosamine in rats.Methods The SD rats were divided into four groups：normal group，Dahuang（Rhei Radix Et Rhizoma）treatment group，DEN treatment group，and 7 李思博，闫美怡，刘阳.降血脂中药功效分类及作用机制研究进展 J .辽宁中医药大学学报，2021，23(5 )：166-169.8 陈文林，范湘旭，梁芳，等.祛湿活血降脂方慰脐法治疗高脂血症性脂肪肝疗效观察 J .山西中医，2021，37(5 )：45-47.9 李树洲.红花黄色素注射液、血塞通注射液、丹参注射液、灯盏花素注射液对2型糖尿病模型动物血糖的影响 D .哈尔滨：黑龙江中医药大学，2021.10 刘丽萍，陈娥.红花黄色素注射液联合阿替普酶对急性脑梗死患者神经功能及炎症指标的影响 J .基层医学论坛，2020，24(26 )：3772-3773.11 陈可冀，付长庚，丛伟红，等.红花黄色素临床应用中国专家共识 J .中国中西医结合杂志，2017，37(10 )：1167-1173.12 崔冠楠.红花黄色素注射剂的综合评价研究 D .郑州：河南中医学院，2015.13 李佳霖，张维.红花黄色素注射液对AECOPD合并肺动脉高压患者血流动力学和氧化应激的影响 J .医学信息，2020，33(17 )：54-57.14 向玉.活血化瘀类中药注射剂治疗中风的效果比较研究 D .广州：广州中医药大学，2017.15 曾妙麟.活血化瘀注射剂联合阿司匹林对缺血性中风患者血小板功能影响的研究 D .武汉：湖北中医药大学，2013.16 方翔，李侠，刘旭辉.红花黄色素治疗老年糖尿病肾病合并急性心肌梗死患者的临床观察 J .中国药房，2017，28(29 )：4140-4143.17 袁靖，陈卫东.红花黄色素在心脑血管系统疾病治疗中的应用进展 J .医学研究生学报，2015，28(5 )：557-560.18 杨茂波.补阳还五汤、少腹逐瘀汤、丹参饮对高脂血症大鼠红细胞膜组分的影响 D .哈尔滨：黑龙江中医药大学，2015.19 刁婷婷，闵清.高脂血症动物模型研究进展 J .湖北科技学院学报（医学版），2018，32(6 )：541-545.20 张伟，巴图得力根，韩志强，等.高脂饮食致大鼠脂肪肝实验模型的建立 J .中国民族民间医药，2015，24(15 )：19-20.21 牛雯颖，刘真真，黄爱云，等.白金丸水溶剂治疗高脂血症小鼠的实验研究 J .上海中医药杂志，2016，50(8 )：75-77.22 金跃，李靖，郑铁生，等.克氏螯虾壳聚糖对实验性大鼠脂肪肝的影响 J .江苏大学学报（医学版），2010，20(6 )：488-491.23 陈博，沈燕慧，卢伟，等.油酰乙醇胺对高脂血症大鼠降血脂及肝脏的保护作用 J .中国生化药物杂志，2011，32(5 )：374-377.24 付琳，苏瑾，杨春荣，等.非诺贝特微球对高血脂模型大鼠降脂作用研究 J .广州化工，2020，48(15 )：91-94.25 何其胜，王爱萍，王龙海.红花黄色素对伴应激性高血糖脑梗死患者糖代谢、C-肽水平及凝血功能的影响 J .临床和实验医学杂志，2019，18(5 )：504-508.26 李玮玮，陈路，刘春慧.红花黄色素对脑血管疾病的机制及药理作用研究进展 J .世界最新医学信息文摘，2016，16(A0 )：71-72.27 张欢，张立伟.红花黄色素抗氧化活性研究 J .化学研究与应用，2012，24(5 )：715-721.DOI：10.13194/j.issn.1673-842x.2023.01.00415 25 卷 辽宁中医药大学学报 大黄（Rhubarb）是临床常用中药，为蓼科植物掌叶大黄（Rheum palmatum L.）、唐古特大黄（Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.）或 药 用 大 黄（Rheum officinale Baill）的干燥根及根茎，是我国传统的大宗中药材，临床应用极其广泛。具有活血化瘀、泻火解毒、逐瘀攻积的功效1。现代药理学表明，大黄具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、保肝、保肾、心血管保护、免疫调节等作用2-3。近些年来研究发现大黄中的游离蒽醌类衍生物如大黄酸、大黄素、芦荟大黄素等具有良好的肝保护作用，主要保护肝脏免受氧化、纤维化、肝硬化、肝细胞癌和各种肝炎的损害4-6。研究表明，大黄主要通过阻断c-junN末端激酶（JNK）通路途径和降解基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的活性抑制转化生长因子-（transforming growth factor-，TGF-）诱 导 的 肝 星 状 细 胞（hepatic stellate cell，HSC）的迁移，以缓解和治疗肝纤维化（hepatic fibrosis）疾病7。大黄酸处理乳腺癌细胞时，可促进细胞蛋白质的错误折叠以及内质网（ER）应激，最终引起细胞凋亡8。也有研究发现大黄素能显著降低肿瘤细胞 CD155的表达，抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，诱导细胞周期阻滞于G2/M 期，促进细胞的凋亡9。郭冶等10证实大黄酸可以显著降低肝纤维化中-平滑肌肌动蛋白（-smooth muscle actin，-SMA）、基质金属蛋白酶抑制剂-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）的表达，这表明大黄酸对大鼠肝纤维化具有一定的治疗作用。然而，近些年国内外有研究表明，大黄会引起肝毒性11-15。研究表明大黄素可以通过损害线粒体功能、抑制谷胱甘肽的合成并且影响脂肪酸的代谢，引起肝毒性。此外，大黄素浓度越高，谷胱甘肽（GSH）代谢功能障碍越严重，引起的肝损伤程度越大16-17。YANG J等18在实验组大鼠血浆中共检测到9种水提物中的植物化学物质，将其分别作用于人肝癌细胞（HepaRG细胞）后发现，大黄酸、大黄素等对细胞产生的毒性作用极强，可明显抑制细胞活力。这些研究表明大黄对肝脏具有“双向”作用。由于大黄在临床上的广泛使用，大黄的肝毒性不容忽视，而大黄治疗肝癌的有效性和安全性需要进一步评估。由田19发现使用4 g/kg剂量大黄处理小鼠，小鼠肝脏无明显的毒性作用，当大黄剂量为8 g/kg时，对小鼠的肝脏具有毒性作用。然而评估大黄的毒性不仅仅局限于正常大鼠中，同时也应该在模拟临床疾病状态的动物模型中评估大黄的毒性和安全性，以进一步深入研究大黄治疗肝癌的有效性和安全性。二乙基亚硝胺（diethylnitrosamine，DEN）是一种在实验动物中广泛使用的致癌剂，其作为一种致癌物与人类原发性肝细胞癌在病因学上存在着一定的相似性20。DEN致大鼠肝癌模型是模拟人类肝癌发生、发展的常用模型之一。肝脏是三大物质代谢的重要器官。已有研究表明，糖代谢的变化与肝纤维化以及肝癌的发生、发展密切相关21-22。但具体机制目前尚不清楚。因此我们从糖代谢适应性改变的角度，探究大黄联合二乙基亚硝胺对于大鼠肝癌前损伤是否具有促进作用，以期为大黄在临床上更加合理安全有效地使用提供一定的依据。1材料SD大鼠（NO.SCXK2017-001）购自安徽医科大学实验室动物中心；大黄颗粒（批号：9045611）由广东一方制药有限公司生产，购自安徽中医药大学第一附属医院（由安徽中医药大学陈光亮教授鉴定），使用时用开水将其配置成相当于生药量1 g/mL；DEN购自美国Sigma公司，使用时用0.9%氯化钠注射液稀释成0.02%浓度；白藜芦醇（resveratrol）购于上海罗恩试剂公司；BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司；RIPA裂解液购自上海碧云天生物科技有限公司；多聚甲醛购自美Dahuang（Rhei Radix Et Rhizoma）+DEN treatment group.Glutamic-pyruvic transamin