大豆蛋白-黄芩素的结合机制及蛋白构象和功能变化_闫馨月.pdf

食品化学 食品科学 2023,Vol.44,No.04 91大豆蛋白-黄芩素的结合机制及蛋白 构象和功能变化闫馨月1，贾亦佳1，孙诗艳1，张东蒙1，耿梦洁1,2，杨晋杰1,2，Stanislav SUKHIKH2,Olga BABICH2，齐宝坤1,3,*，李 杨1,3,*（1.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.康德波罗的海联邦大学生命系统学院，俄罗斯 加里宁格勒 236016；3.国家大豆工程技术研究中心，黑龙江 哈尔滨 150050）摘 要：探索大豆蛋白组分中-伴大豆蛋白（7S）/大豆蛋白（11S）与黄芩素的结合机制，考察复合物构象及功能特性的变化。傅里叶变换红外光谱表明黄芩素诱导蛋白的-折叠转化为-螺旋和无规卷曲。内源荧光光谱证实了黄芩素的加入使7S、11S结构变得更紧密。黄芩素与蛋白的反应自发进行，并通过静态方式猝灭蛋白荧光。7S、11S蛋白分别通过氢键和疏水相互作用与黄芩素结合。分子对接结果表明，黄芩素对11S的亲和力高于7S。扫描电子显微镜显示了7S、11S与复合物的微观结构差异。此外，与黄芩素结合后，7S、11S的表面疏水性下降，热稳定性及其他功能特性提升。关键词：-伴大豆蛋白（7S）；大豆蛋白（11S）；黄芩素；结合机制；构象变化；功能特性Binding Mechanism and Conformation and Functional Changes of Soybean Protein-Baicalein Complexes YAN Xinyue1,JIA Yijia1,SUN Shiyan1,ZHANG Dongmeng1,GENG Mengjie1,2,YANG Jinjie1,2,Stanislav SUKHIKH2,Olga BABICH2,QI Baokun1,3,*,LI Yang1,3,*(1.College of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Institute of Life Systems Research,Immanuel Kant Baltic Federal University,Kaliningrad 236016,Russia;3.National Research Center of Soybean Engineering and Technology,Harbin 150050,China)Abstract:This study aimed to explore the binding mechanism of soybean-conglycinin(7S)/glycinin(11S)with baicalein,and to investigate the changes in the conformational and functional properties of the complexes.Fourier transform infrared(FT-IR)spectroscopy indicated that baicalein could induce the transformation of-sheets into-helices and random coils.Intrinsic fluorescence spectra confirmed that the addition of baicalein made the structure of 7S and 11S more compact.The reaction of baicalein with the proteins took place spontaneously and quenched the protein fluorescence in a static manner.The 7S and 11S proteins bound to baicalein by hydrogen bonds and hydrophobic interactions,respectively.Molecular docking results showed that the affinity of baicalein to 11S was higher than that to 7S.Scanning electron microscopy(SEM)showed microstructure differences between 7S and 11S and their complexes.In addition,the surface hydrophobicity of 7S and 11S was decreased and the functional properties such as thermal stability were improved after combining with baicalein.Keywords:-conglycinin(7S);glycinin(11S);baicalein;binding mechanism;conformational change;functional propertiesDOI:10.7506/spkx1002-6630-20220519-255中图分类号：TS214.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2023）04-0091-08引文格式：闫馨月,贾亦佳,孙诗艳,等.大豆蛋白-黄芩素的结合机制及蛋白构象和功能变化J.食品科学,2023,44(4):91-98.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220519-255.http:/收稿日期：2022-05-19基金项目：国家大豆产业技术体系岗位科学家项目（CARS-04-PS32）第一作者简介：闫馨月（1998）（ORCID:0000-0003-0188-3143），女，硕士研究生，研究方向为粮食、油脂及植物蛋白工程。E-mail:*通信作者简介：齐宝坤（1986）（ORCID:0000-0001-6937-8763），男，副教授，博士，研究方向为粮食、油脂及植物蛋白工程。E-mail:李杨（1981）（ORCID:0000-0001-8758-5512），男，教授，博士，研究方向为粮食、油脂及植物蛋白工程。E-mail:92 2023,Vol.44,No.04 食品科学 食品化学大豆蛋白是日常膳食中优质蛋白质的重要来源，由2S、7S、11S和15S这4 类蛋白质组成，其中-伴大豆蛋白（7S）和大豆蛋白（11S）是大豆蛋白质的2 种主要成分，分别占总质量的40%和30%1。7S组分由（71 kDa）、（67 kDa）和（50 kDa）亚基通过氢键和疏水相互作用堆积而成，11S组分由酸性亚基（3742 kDa）和碱性亚基（1720 kDa）通过疏水键和二硫键连接组成2。先前研究表明，7S组分决定大 豆蛋白的乳化和起泡能力，11S组分决定大豆蛋白的凝胶性能3。这表明不同组分蛋白由于其功能性的差异可以在食品加工中发挥不同作用4。黄芩素是从高黄芩根部提取的天然黄酮类化合物，具有抗菌、抗肿瘤、抗过敏、抗氧化等功效，但由于其水溶性和稳定性较差，生物利用度低等问题，其应用始终受限。因此，国内外学者不断运用新型的制剂手段，挖掘不同的搭载材料，以开发出有实际应用价值的黄芩素制剂5。近年来，随着对功能性复合食品体系的需求增加，蛋白质与多酚之间的相互作用越来越受到关注。据报道，蛋白质与多酚的结合既能改善蛋白质的物理化学性质6，同时也能提高多酚的生物可及性和生物利用度。研究证明，多酚通过非共价和（或）共价相互作用对蛋白质有很强的结合亲和力7。Ye Jiangping等8发现芦丁与大豆分离蛋白以疏水作用力结合，复合物乳液具有良好的物理稳定性。扁豆蛋白与多酚的非共价相互作用对蛋白的热稳定性以及氧化活性有显著提升9。在大豆蛋白素肉加工过程中添加不同含量的茶多酚可优化产品的色泽、质构性质和结构特性10。蛋白质作为多酚的稳定剂和载体，可保护它们在胃肠消化过程中免受酶促和氧化降解，并将其输送到小肠和结肠3。随着对蛋白-多酚复合物的深入研究，越来越多的酚类化合物作为生物活性物质或改性材料应用到工业食品生产中。本研究选取7S、11S蛋白与黄芩素作为研究对象，利用多光谱技术和分子对接探究大豆蛋白-多酚的结合机制以及结构变化，进一步测定复合物的稳定性和功能特性。通过实验和理论相结合的方法，阐明7S、11S与黄芩素的相互作用机理。本研究有助于提升大豆蛋白在工业生产中的功能性，同时可以促进黄芩素作为口服营养成分的应用。1 材料与方法1.1 材料与试剂脱脂豆粉 东北农业大学大豆研究所；黄芩素 上海源叶生物科技有限公司；8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）美国Sigma-Aldrich公司；HCl、NaOH（均为分析纯）北京新光化学试剂厂。1.2 仪器与设备GL-20G-II高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；PHSJ-4A型实验室pH计 中国上海雷磁公司；电子分析天平、F-6000荧光分光光度计 日本岛津公司；FD5-3型冷冻干燥机 美国SIM公司；MAGNA-IR560傅里叶变换红外光谱仪 美国尼高力仪器股份有限公司；Tecan Infinite 200 Pro多功能酶标仪 瑞士帝肯公司；TGA/SDTA851e差热分析仪 瑞士梅特勒-托利多公司；T18basic高速乳化均质机 英国IKS公司；TM3000扫描电子显微镜 日本Hitachi公司。1.3 方法1.3.1 7S、11S蛋白组分以及大豆蛋白-黄芩素复合物的制备参照Liu Chun等11的方法，并略作修改。脱脂豆粉溶解于去离子水，料液比为1 15（g/mL），用2 mol/L NaOH溶液调节pH值至9.0，低速搅拌1 h，4、9 000g离心30 min，收集上清液。重新溶解沉淀，调节pH值至9.0，低速搅拌1 h，相同条件下离心并混合上清液。添加0.01 mol/L NaHSO3溶液，用2 mo1/L HCl溶液调节pH值至6.4，4 贮藏过夜。取溶液于4、6 500g离心20 min，水洗沉淀3 次，用去离子水溶解后调节pH值至7.5，冻干后可得11S蛋白组分。向上述上清液中加入NaCl至离子浓度为0.25 mo1/L，用2 mo1/L HCl溶液调节pH值至5.4，4、9 000g离心30 min。取上清液，加入等体积去离子水，用HC1溶液调节pH值至4.8，4、6 500g再次离心20 min。取沉淀，水洗3 次后用去离子水溶解，调节pH值至7.5，冻干后可得7S蛋白组分。称取一定质量黄芩素溶解于甲醇溶液中作为母液，质量浓度为10 mg/mL，置于20 保存。混合前使用Tris-HCl缓冲液将母液稀释至质量浓度为1 mg/mL。将7S和11S蛋白组分分别溶解在Tris-HCl缓冲液中，质量浓度均为1 mg/mL。将蛋白与多酚溶液混合，室温下低速搅拌30 min。使用3 000 Da分子质量的截止膜将混合液在去离子水中透析48 h，冷冻干燥后获得7S-黄芩素、11S-黄芩素复合粉末。1.3.2 傅里叶变换红外光谱测定测定前取1.5 mg样品与200 mg溴化钾研磨混匀并压片。波数范围4 000400 cm1，扫描次数64，分辨率4 cm1，得到的红外光谱曲线用Peak Fitting软件拟合，分析复合物二级结构含量的变化12。1.3.3 内源荧光光谱测定参照Liu Yan等13的方法，并略作修改。采用YAN Xinyue,JIA Yijia,SUN Shiyan,et al.Binding mechanism and conformation and functional changes of soybean pro