大孔树脂分离纯化银杏叶提取物生产柱层析废液中奎宁酸_王秋萍.pdf

第 卷第 期 年 月广 州 化 工 .大孔树脂分离纯化银杏叶提取物生产柱层析废液中奎宁酸王秋萍，李 俊，何 珺，宋善敏，杨邦祝，雷 阳，艾 强（贵州农业职业学院食品与药品系，贵州 清镇；贵州大学贵州省生化工程中心，贵州 贵阳）摘 要：为探究银杏叶提取物生产柱层析废液中奎宁酸工艺的最佳参数。以吸附率和解析率为指标，采用静态吸附试验对 种大孔树脂进行筛选，并通过动态吸附试验纯化条件。结果表明 树脂不易碎，经处理后，可反复利用，对奎宁酸有较好的吸附和解析附效果。最佳纯化工艺参数为：径高比为:的 树脂，上样液 ，上样流速 ，纯净水除杂水洗到无色后，甲酸进行洗脱。研究为银杏叶生产柱层析废液中奎宁酸回收利用提供了技术依据。关键词：银杏叶提取物；柱层析废液；奎宁酸；大孔树脂；纯化；资源回收中图分类号：文献标志码：文章编号：（）基金项目：贵州省教育厅职业教育科研项目（）；贵州省科技计划项目（黔科合，一般）；贵州农业职业学院院级科研项目重点课题（）。第一作者：王秋萍（），女，博士研究生在读，讲师，主要从事制药工程及药品质量安全研究。通讯作者：何珺（），女，硕士，副教授，主要天然产物活性成分分离提取及分析测试研究。，（，；，）：，：:，：；银杏叶（）为银杏树的干燥叶片，银杏叶中含有黄酮类、萜内酯类、绿原酸、莽草酸、奎宁酸等；版中国药典收录的银杏叶提取物，从银杏叶中提取黄酮、内酯、银杏酸类成分的提取物，其在食品及药品中开发利用较多。在其生产过程中会产生大量银杏叶提取物生产柱层析废液，经检测废液中含有奎宁酸和莽草酸。奎宁酸与莽草酸在银杏叶中常共生存在。磷酸奧司他韦是一种高效、高选择性神经氨酸酶抑制剂，年首先在瑞士上市，年 月在我国上市。是目前治疗流感的最常用药物之一，也是公认的抗禽流感、甲型 病毒最有效的药物之一。磷酸奥斯他韦最早在工业上是采用奎宁酸进行合成，后由于原料植物提取率低，工业化生产成本较高，转而使用莽草酸进行合成。目前市场上莽草酸主要来源于八角，但近年来八角价格不断攀升，导致工业成本提高，市场急需寻求低价原料代替目前市场上对银杏叶提取物生产柱层析废液现有研究报道主要对莽草酸进行分离纯化，广 州 化 工 年 月没有对其中奎宁酸进行富集纯化的相关报道。因此，本研究对银杏叶生产柱层析废液中奎宁酸进行回收纯化，能够更大程度的将银杏叶资源进行利用，降低各产品的综合生产成本、增加社会经济效益，具有巨大的科学意义和应用前景。更对振兴我省“十大工业产业”、推动我省“四化”建设和助推我省社会经济发展具有重大的意义。实 验.仪器、材料和试剂 分析型，.；柱（.，）色谱柱，大连依利特分析仪器有限公司；电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；其他为一般常规仪器。不同厂家取得的银杏提取物生产柱层析废液。甲醇（色谱纯），德国；磷酸（分析纯），成都金山化学试剂有限公司；娃哈哈纯净水，贵阳娃哈哈昌盛饮料有限公司；（）奎宁酸对照品（批号：，），北京万佳首化生物科技有限公司；、大孔型阴离子、（）和 十种型号树脂，沧州宝恩化工公司。.实验方法.银杏叶提取物生产柱层析废液中奎宁酸含量测定（）线性关系考察精密称定奎宁酸对照品.，置于 容量瓶中，加适量水溶解，定容，混匀，制得浓度为.的奎宁酸对照品溶液。分取、.、，.的奎宁酸标准储备液于 试管中，加水稀释至刻度线，混匀，得到浓度为、.、.、.、.的奎宁酸溶液。采用 进行检测，进样量为 ，按色谱条件色谱柱：柱（.，）；流动相：.磷酸水:甲醇（:，）；流速：.；柱温：；示差检测器，进样量 ，样品上机前过.微孔滤膜。在 上进样分析并记录色谱图，以奎宁酸的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行回归分析。奎宁酸回归方程为.，.，表明浓度在.呈良好的线性关系。（）奎宁酸含量测定分别精密吸取奎宁酸对照品溶液，供试品溶液各 ，注入高效液相色谱仪中进行测定，记录各自的峰面积，根据奎宁酸标准溶液峰面积与浓度的线性关系即可计算出奎宁酸的含量。.静态吸附筛选大孔树脂型号（）树脂预处理分取、大孔型阴离子、（）和 十种型号树脂，采用 乙醇浸泡 ，后用蒸馏水淋洗至无醇味，配置浓度为 的氢氧化钠溶液浸泡 ，蒸馏水淋洗至中性，再用 盐酸浸泡 ，最后采用蒸馏水淋洗至中性，即得预处理后的树脂，备用。（）上柱液制备将从不同厂家取得的银杏提取物生产柱层析废液用水稀释，确保上柱液密度低于树脂密度。（）树脂型号筛选将预处理后的树脂抽滤，分别精密称定 树脂，置于 的三角瓶中，贴好标签，并向三角瓶中分别加入 上柱液。将三角瓶放入 恒温摇床，固定，以 的转速振荡吸附 ，使奎宁酸、充分吸附。后取出，滤过。分别取 滤液于试管中，加 纯水稀释至十倍，过.微滤膜，注入进样小瓶，即得供试品。对供试品中奎宁酸含量进行测定，并计算饱和吸附量（）。饱和吸附量（原料液质量浓度原料液体积流出液质量浓度流出液体积）树脂质量.动态吸附洗脱参数考察（）泄露曲线分别称取处理好的（）树脂、大孔型阴离子树脂、树脂各 ，装柱填充均匀无气泡。再分别量取三份 上柱液对上述三种不同型号的树脂的上柱。上柱时，以 的流速进行平行操作。每 为一个流份，收集流出液。分别取 置于 试管中，加水 稀释至刻度线，摇匀。过.滤膜，注入进样小瓶中。得待测供试品。对各流份中奎宁酸含量进行测定。以奎宁酸泄露质量浓度为纵坐标（），收集流份为横坐标（）作泄露曲线。（）上样流速分别称取 （）、大孔型阴离子吸附树脂各三份，标记并装入型号大小都相同的层析柱中。分取 份 质量浓度相同的上柱液，两种型号的树脂分别以 、以及 的流速上样，进行动态吸附，收集流出液，每 为一个流份，每个层析柱收集 份。将各流份分取 稀释十倍，过.滤膜，注入进样瓶中，测量每一份中奎宁酸的含量，并计算流出液中奎宁酸的质量浓度。（）洗脱剂甲酸浓度的筛选称取预处理后的（）、树脂 （）各五份，分别装入规格相同的五根层析柱中，量取十份 的等质量浓度上柱液，以 的流速上样，收集流出液；用 纯水洗至流出液没有颜色，再分别用、的甲酸各 进行洗脱，并分别收集各甲酸洗脱液。采用高效液相色谱法测定不同体积分数的甲酸洗脱剂所中奎宁酸的含量，并计算出奎宁酸的含量及解析率（）。解吸率（洗脱液质量浓度洗脱液体积）（原料液质量浓度原料液体积流出液质量浓度流出液体积）（）洗脱剂用量筛选取两相同层析柱，称取 （）处理好后的（）、型大孔吸附树脂，分别湿法装入层析柱中，再量取两份 的银杏叶提取液，以 的流速上样，接出流出液 ，用 纯水洗至流出液无色，得 水洗液。再分别采用 甲酸（）、甲酸（）对两者进行洗脱，每 洗脱液接一份，测定其中奎宁酸含量。（）上柱液 筛选分取 份相同浓度原料液，采用、对原料液 值进行调节。调取、三个 值的上柱液各两份，分别上柱到（）、树脂中进行吸附解析实验。上样流速为 ，采用 水洗，（）树脂采用 的甲酸进行洗脱，树脂采用 的 甲酸进行洗脱。分别收集流出液、水洗液以及洗脱液，并对上柱液、流出液、水洗液和洗脱液中奎宁酸含量进行测定和计算。结果与分析第 卷第 期王秋萍，等：大孔树脂分离纯化银杏叶提取物生产柱层析废液中奎宁酸 .不同树脂静态吸附量和解析率比较由表 可知，、大孔型阴离子、（）三种树脂对奎宁酸的吸附效果均较好，其中（）树脂的吸附效果最好。初步考虑，选择、大孔型阴离子、（）三种大孔吸附树脂作为泄露曲线考察实验的吸附树脂。表 树脂静态吸附表 树脂型号奎宁酸吸附量（）奎宁酸解析率.（）.动态吸附洗脱参数考察.泄露曲线结果由表 可知，（）树脂：第 份流出液中奎宁酸含量为.。第 份到第 份流出液中奎宁酸的泄漏量呈缓慢上升趋势，第 份到第 份泄露得相对较多。其中，第 份流出液中奎宁酸含量为.；大孔型阴离子树脂：第 份流出液中奎宁酸含量为.。第 份到第 份流出液中奎宁酸的泄漏量呈上升趋势。其中，第 份流出液中奎宁酸含量为.。第 份为一转折点，第 份泄漏量最高，第 份开始呈下降趋势。树脂：从第一份流出液开始，流出液中奎宁酸含量达.。从第 份流出液开始至第 份流出液，奎宁酸的含量呈逐步缓慢上升趋势。综合上述结果，树脂整体泄漏量明显大幅度高于（）和 大孔型阴离子树脂。（）和 大孔型阴离子树脂泄露不严重，其中以 （）型树脂效果最好。表 （）、树脂树脂泄露曲线结果 （），流份序号（）树脂奎宁酸质量浓度（）大孔型阴离子树脂奎宁酸质量浓度（）树脂奎宁酸质量浓度（）.上样流速筛选由表 可知，针对（）、两种型号的树脂考察不同上样流速对奎宁酸和莽草酸的吸附效果，流速上样效果相较于 、更好，能够更充分的吸附。所以建议后续采用 流速上样。表 （）、树脂流速上样实验结果（奎宁酸）（），（）树脂（）树脂奎宁酸浓度（）树脂奎宁酸浓度（）.洗脱剂甲酸浓度筛选由表 可知，随着甲酸浓度的提高，（）树脂中奎宁酸的解析率逐渐降低，最佳解析率时的甲酸浓度为；树脂中奎宁酸解析效果呈先升后降趋势，当甲酸浓度为时解析效果极差，当甲酸浓度达到 时，达到解析率的峰值。综上，建议选取 甲酸浓度作为（）树脂中的奎宁酸洗脱剂，甲酸浓度作为 树脂中奎宁酸的洗脱剂。表 （）、树脂不同甲酸浓度解析效果 （），甲酸浓度（）树脂奎宁酸解析率 树脂奎宁酸解析率.洗脱剂用量筛选表 甲酸洗脱剂用量筛选（）、树脂）（），）洗脱剂用量 甲酸洗脱（）树脂）奎宁酸（）甲酸洗脱（树脂）奎宁酸（）.由表 可知：洗脱剂用量在 体积时，洗脱液中奎 广 州 化 工 年 月宁酸浓度较高，体积时，洗脱液中奎宁酸浓度显著降低。当洗脱剂用量达到 时，洗脱液中奎宁酸含量极低，可忽略不计。而当洗脱剂用量达到 时，洗脱液中已经不存在奎宁酸。因此，建议在使用 甲酸对（）、甲酸对 树脂中吸附的奎宁酸时采用 洗脱剂用量为宜。.上柱液 筛选由表 可知，当上柱液的 值过低达到 时，（）和 树脂均不能良好的将奎宁酸吸附，大量奎宁酸富集中在水洗液中，不能达到树脂吸附除杂的效果。当上柱液的 值过低达到 时，（）和 树脂能有效对上柱液中的奎宁酸进行吸附洗脱时随着洗脱液流出柱子，且奎宁酸的解析率可达 以上。因此建议采用（）和 两种型号的树脂对奎宁酸进行分离除杂时，使 值达到，才能更有效的对奎宁酸起到吸附、分离、除杂的作用。表 （）、树脂 不同 筛选 （），（）树脂 树脂流出液（）水洗液（）洗脱液（）解析率 流出液（）水洗液（）洗脱液（）解析率.结 论（）因奎宁酸结构中基团的影响，奎宁酸显酸性，为避免可能由于酸性的理化性质与树脂之间发生反应，因此对树脂中奎宁酸的吸附与解析产生影响，故对上柱液的 值进行调节，考察最佳 值。（）在实际生产应用调查时发现，（）树脂由于颗粒小，易碎，在大生产中容易堵塞柱子，且回收利用度低，造成工业成本的增大。相较于（）树脂，树脂不易碎，经处理后，多次反复利用。因此，建议工业大规模使用树脂对奎宁酸进行富集除杂时采用 树脂为宜。（）将银杏叶提取物生产柱层析废液作为原料液，采用静态吸附试验对 种大孔树脂进行筛选，优选出吸附解析性能最佳的 种大孔树脂，通过动态吸附试验优化纯化条件，确定最佳工艺参数。最佳纯化工艺参数为：径高比为:的 树脂，上样液 值在 区间，上样流速为，纯净水除杂水洗到无色后，甲酸进行洗脱。（）本项目在保留厂家原有生产路线的情况下，选取生产废液作为实验原料，可对银杏叶提取物生产柱层析废液中奎宁酸进行回收纯化利用、提高银杏叶中药材的综合利用度，降低各产品的综合生产成本、增加社会经济效益。参考文献 国家药典委员会.中华人民共和国药典.一部北京：中国医药科技出社，：.刘祖雄，张红，王志朝.抗甲型 流感病毒前沿新药磷酸奥司他韦中国药业，（）：.，.（，）（.，）.（），（）：.，.：，.（），：.，.，（）：.龚晓明，许激扬，丁玉林.抗流感病毒新药 的合成改进中国新药杂志，（）：.李俊，陈伟，杨明武，等.银杏叶中奎宁酸和莽草酸的综合提取研究应用化工，（）：.刘东彦，张莉霞，杜瑞琴，等.大孔吸附树脂同时纯化雪松松针中的莽草酸和总黄酮中草药，（）：.