大黄鲜切过程对化学成分、泻...抗炎及体外抗氧化活性的影响_李东辉.pdf

制剂与炮制收稿日期：；修订日期：基金项目：国家自然科学基金（；）；甘肃省教育厅产业支撑计划项目（）；甘肃省科技计划基础研究创新群体项目（）；甘肃省中药制药工艺工程研究中心开放课题（）作者简介：李东辉（），男（汉族），甘肃定西人，甘肃中医药大学在读硕士研究生，主要从事中药及复方加工炮制机理及活性成分研究工作通讯作者简介：李越峰（），女（汉族），甘肃兰州人，甘肃中医药大学教授，博士学位，主要从事中药及复方加工炮制机理及活性成分研究工作大黄鲜切过程对化学成分、泻下、抗炎及体外抗氧化活性的影响李东辉，吴红伟，李国峰，杨新荣，李咸慰，宋沁洁，司昕蕾，边甜甜，张育贵，孙宇靖，李越峰（甘肃中医药大学，甘肃省中药制药工艺工程研究中心，甘肃 兰州）摘要：目的 研究大黄鲜切过程对化学成分、泻下、抗炎及体外抗氧化活性的影响。方法 利用 技术对大黄鲜切晾干过程的化学成分峰面积进行测定，采用 技术考察鲜切过程中各样品对 自由基及 自由基的清除能力，并考察此过程中的泻下作用及抗炎作用。结果 大黄各样品中各化学成分峰面积均呈现减少趋势，大黄切面颜色及色度值变化明显，大黄样品对 自由基及 自由基的清除能力，泻下作用及抗炎作用均呈现减少趋势。结论 大黄鲜切过程中各样品颜色及化学成分变化明显，对自由基清除能力及泻下抗炎作用均减弱。关键词：大黄；鲜切；化学成分；颜色；自由基；泻下；抗炎 标识：中图分类号：文献标识码：文章编号：（），（，）：，：；大黄始载于神农本草经，药用历史悠久，是我国的大宗中药材之一，主要含有蒽醌类衍生物、鞣质类、蒽酮类、苯丁酮类、酚酸类、鞣质类等，具有泻下、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、保肝等作用，。研究表明大黄发挥泻下作用主要与醌苷类成分相关，阻碍主动转运过程，降低 转运吸收程度，促进肠道蠕动。研究也表明，大黄的抗炎作用主要与降低白细胞介素及肿瘤坏死因子水平，降低内毒素的生成等相关。自由基衰老学说认为氧化反应是诱导生物衰老与诱发多种疾病的主要起因，其中自由基主要由氧自由基与其他自由基。一些活性物质可直接或间接作用于自由基，以逆转自由基对机体细胞的氧化攻击。当前，如丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲醚、没食子酸丙酯等合成型抗氧化剂均具有一定的细胞毒性，。法和 法可用于大样本测定及亲水性和亲脂性物质的抗氧化能力测定。目前，大黄因其富含酚酸类成分，其抗氧化作用也被受关注。已有研究发现含蒽醌类成分中药也表现出较好的体外抗氧化活性，如大黄中的大黄素 葡萄糖苷及总蒽醌苷，大黄中的没食子酸、儿茶素或表儿茶素、桂皮酰 没食子酰葡萄糖对 自由基的清除能力较强。中国药典规定，大黄饮片断面外表皮应为黄棕色或棕褐色。有研究表明大黄鲜切中室外 ，室内 即出现切面黑褐色现象。近年来，色度学分析方法广泛用于医药产业。高效液相色谱技术是一种比较新的药物成分分析技术。紫外可见分光光度计具有应用广泛、灵敏度高、选择性好、适用浓度范围广等特点。这为检测大黄鲜切晾干过程中的样品切面颜色色度值，检测各样品化学成分动态变化提供基础，而中药发挥药效作用的物质基础与化学成分密切相关。鉴于此，基于大黄化学成分的基础上，研究大黄鲜切过程中的泻下作用，抗炎作用及体外抗氧化作用具有一定意义。时珍国医国药 年第 卷第 期 材料与仪器 实实验验药药材材 试验所用新鲜大黄药材采自甘肃省陇南市礼县石桥镇，经甘肃中医药大学药学院中药鉴定教研室王明伟副教授鉴定为蓼科植物掌叶大黄 的根和根茎。试试剂剂 没食子酸、儿茶素、表儿茶素、芦荟大黄素 葡萄糖苷、大黄素 葡萄糖苷、大黄酸 葡萄糖苷、大黄酚 葡萄糖苷、大黄素甲醚 葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚及大黄素甲醚均购自成都普思生物科技股份有限公司（质量分数）。其他试剂见表。表 主要实验试剂序号名称生产厂家批号考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒南京建成生物工程研究所 酶测定试剂盒南京建成生物工程研究所二甲苯烟台市双双化工有限公司阿司匹林肠溶片石药集团欧意药业有限公司，二苯基 苦基肼（）上海源叶生物科技有限公司，联氨 二（乙基苯并噻唑啉 磺酸）二铵盐（）上海源叶生物科技有限公司 仪仪器器设设备备 主要实验仪器见表。表 主要实验仪器序号名称生产厂家型号高效液相色谱仪美国 公司 紫外分光光度计北京莱伯泰科仪器股份有限公司 万分之一分析天平上海梅特勒 托利多仪器有限公司十万分之一分析天平北京赛多利斯科学仪器有限公司数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司 色差仪深圳三恩驰科技有限公司 梅特勒 托利多水分测定仪梅特勒 托利多仪器有限公司 小鼠代谢笼意大利 公司 动动物物 级昆明种小鼠，雌雄各半，体重 ，购自甘肃中医药大学实验动物中心，许可证号（甘）。器器械械 碘伏，棉签，灌胃针，一次性注射器，手术器械等。方法 大大黄黄鲜鲜切切过过程程样样品品制制备备 将新鲜大黄药材除去泥土、须根，刮去外皮，切制成厚度为 的饮片，将上述饮片分为 的若干份，晾干，在 、时间点（即 内）依次取上述样品标为 号。各各样样品品色色度度值值测测定定 测定光源为；色彩空间为，；测量几何结构。；侦测器为硅光电二极管；测量孔径 ；定位方式为光照定位和十字架定位；光源为 蓝光激发。为减少不同仪器间产生的误差，故选定一张白纸为标准样品，将 号样进行色度值测量，重复测量 次，取平均值，按公式 （）计算总色差值。中的代表亮度，与 分别代表黑色和白色 代表红绿色轴，负值与正值分别代表绿色与红色；代表黄蓝色轴，负值与正值分别代表蓝色与黄色，三度色彩空间与人眼感觉的色彩具有高度相似。基基于于 的的指指标标成成分分峰峰面面积积测测定定 供供试试品品溶溶液液的的制制备备 将 号样切碎研细，加入 甲醇，称定质量，超声 ，取出冷却，补足减失质量，过 微孔滤膜即得各供试品溶液。对对照照品品溶溶液液的的配配制制 分别精密称取对照品没食子酸、儿茶素、表儿茶素、芦荟大黄素 葡萄糖苷、大黄酸 葡萄糖苷、大黄素 葡萄糖苷、大黄酚 葡萄糖苷、大黄素甲醚 葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚适量，加甲醇超声溶解，配制成依次含，及 的混合对照品溶液，以鉴定样品成分。色色谱谱条条件件 色谱柱为 （，），流动相为乙腈（）磷酸水溶液（），梯度洗脱：，；，；，；，；，；，；，；，。进样量 ；检测波长 ；柱温；体积流量为 。体体外外抗抗氧氧化化试试验验 供供试试品品溶溶液液制制备备 取各样品切碎研细，以 乙醇超声提取 ，过滤，即得供试品溶液。自自由由基基清清除除能能力力测测定定 预先配置 的 溶液。取“”项各供试品溶液 稀释至 作样品液。将试管标记为、。：无水乙醇 溶液；：样品 溶液；：样品 无水乙醇；摇匀后避光反应 ，在 处测吸光度 值。各样品 自由基清除率按照如下公式计算。（）自自由由基基清清除除能能力力测测定定 在避光、室温条件下将 与 的过硫酸钾溶液混合反应 得 储备液。以无水乙醇稀释 储备液至 作为工作液。依次加入 工作液与“”项 供试液，室温、避光放置 ，于 波长处测定，记为。：工作液 无水乙醇；：无水乙醇 供试液。各样品 自由基清除率如上“”项公式计算。泻泻下下及及抗抗炎炎作作用用比比较较研研究究 受受试试药药物物的的制制备备 将新鲜大黄药材除去泥土、须根，刮去外皮，趁鲜切制成厚度为 的饮片多份，每份 ，分别取，时（其中 、，大黄饮片质量分别为、，）饮片加 蒸馏水浸泡 ，煮沸 ，过滤，滤渣再加 蒸馏水煮沸 ，过滤，合并两次滤液，浓缩至 生药。泻泻下下作作用用比比较较 正正常常小小鼠鼠泻泻下下作作用用 取健康昆明小鼠 只，雌雄各半，随机分为空白组，、各高、中、低剂量组，每组 只。实验 当 日 小 鼠 禁 食 不 禁 水 ，空 白 组 给 予 生 理 盐 水（），其余各组按表 给予对应的药物后，将实验小鼠单独放入低下铺有滤纸的代谢笼中，粪便性状分为：水便、溏便、软便、正常。分别观察 内各组的泻下次数、首次泻下时间及总便数。正正常常小小鼠鼠碳碳墨墨推推进进率率的的比比较较 取健康昆明小鼠 只，雌雄各半，随机分为空白组，、各高、中、低剂量组，每组 只。实验前禁食不禁水 ，空白组灌胃含碳墨的生理盐水（），其余各组按表 给予对应的药物，给药 后处死，分离肠系膜，剪取幽门至回盲部的肠管，测量小肠总长及碳墨在小肠内推进的距离，计算碳墨推进百分率。对对小小鼠鼠结结肠肠壁壁细细胞胞 活活性性的的影影响响取健康昆明小鼠 只，雌雄各半，随机分为空白组，、各高、中、低剂量组，每组 只。空白组给予生理盐水（时珍国医国药 年第 卷第 期），其余各组按照表 给予对应药物，连续灌胃给药 。于末次给药 后处死，剪取结肠，预冷的蒸馏水清洗，精确称取 ，加入预冷的生理盐水 ，匀浆制备成匀浆液，离心 ，取上清液 加入 预冷生理盐水稀释成 的匀浆，所得匀浆液在 处，使用超微量 试剂盒和考马斯亮蓝蛋白试剂盒测定其吸光度，并计 算 样 本 的 蛋 白 浓 度（）和 活 力（）。抗抗炎炎作作用用 取健康昆明小鼠 只，雌雄各半，随机分为空白组，阳性对照组，、各高、中、低剂量组，每组 只。空白组给予生理盐水（），实验前禁食不禁水 。空白对照组给予吐温（），阳性对照组给予阿司匹林（），其余各组按照表 给予对应药物，连续灌胃给药，于末次给药 后，小鼠左耳涂二甲苯（只），右耳作为对照，后处死，用直径 的打孔器分别沿左右耳廓相同部位打孔，分别精密称定重量，计算肿胀值，求出肿胀抑制率。统统计计学学方方法法 以上数据结果均采用?表示，若符合正态分布且方差齐，多组间比较采用单因素方差分析（）；若不符合正态分布且方差不齐，用 秩和检验。以上数据均采用 软件进行统计分析，并以 作为差异具有统计学意义的标准。结果 各各样样品品的的色色度度值值、水水分分及及质质量量测测定定结结果果 见图 。图 各样品颜色图 各样品质量及水分变化过程实验结果表明，号样在 内颜色变化明显（即从棕黄色变为黑褐色）见图，值依次为 、及 ，值从 变为 ，值从 、及 ，值 变为 ，值 、及 ，值从 变为 ，总色度 值从 变为 。样品号 ，即大黄鲜切 内，此段时间内颜色变化明显。结果也表明，鲜切过程中各样品水分及质量呈逐渐下降趋势，在 时间点，号样为（），水分达到（）。见图。指指标标成成分分峰峰面面积积测测定定结结果果 见图 。图 大黄样品和混合对照品的 图图 种指标成分峰面积（）及 种指标成分峰面积（）如图 为大黄样品和混合对照品的 图。如图（）与（）所示，种指标性成分峰面积呈减少趋势。前 内 种指标性成分的各峰面积出现一定程度的增加，其后峰面积逐渐减少，这可能是因为组织细胞在遭受机械破坏后，细胞内容物流出量增加导致各成分峰面积呈现短暂上升趋势，其后由于水分流失，大黄机体启动抗干旱机制，其通过渗透调节剂、内源激素、保护酶活性、活性氧清除及膜蛋白保护来适应干旱胁迫，有效成分减少变慢。综上，大黄鲜切晾干过程中化学成分减少明显。各各样样品品对对 自自由由基基清清除除能能力力 号样品，即鲜切 内对 自由基的清除能力较大，其后清除率逐渐减少。这可能是因为鲜切初期大黄的细胞结构遭受破坏其大量化学成分流出，导致对 自由基清除能力增强，其后可能是由于机体启动抗干旱机制及化学成分的流失等多因素导致对 自由基清除能力呈现减弱趋势。见图。各各样样品品对对 自自由由基基清清除除能能力力 号样品，即鲜切 内对 自由基的清除能力较大，其后清除率逐渐减少。对 自由基清除能力呈现减弱趋势。见图。正正常常小小鼠鼠泻泻下下作作用用 各药物组与 高剂量组相比，其首次泻下时间逐渐增长，总便数及泻下次数减少，差异具有统计学意义（）。各药物组总便数由高到低为：高剂量组 高剂量组 中剂量组 高剂量组。表明大黄鲜切晾干过程中的泻下作用呈现不同程度的减弱趋势。见表。时珍国医国药 年第 卷第 期 图 各样品对 自由基的清除能力图 各样品对 自由基的清除能力表 正常小鼠泻下作用的比较（?）组别给药剂量 首次泻下时间 泻下次数 次总便数 次空白组高剂量组（）中剂量组（）低剂量组（）高剂量组（）中剂量组（）低剂量组（）高剂量组（）中剂量组（）低剂量组（）与空白组比较，；正正常常