达格列净通过激活腺苷酸活化...酶途径增强足细胞自噬的研究_熊哲学.pdf

中国糖尿病杂志2023年1月第31卷第1期Chin J Diabetes，January 2023，Vol.31，No.1 糖尿病基础研究 达格列净通过激活腺苷酸活化蛋白激酶途径增强足细胞自噬的研究熊哲学李凝旭唐明娟【摘要】目的探讨达格列净通过激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）途径增强足细胞自噬。方法20 只 45 周龄 SD 雄性大鼠随机选取 6 只为空白对照组（Con），其余有 12 只成功建模 T2DM大鼠，T2DM 大鼠随机分为 T2DM 组及达格列净组（Dap），每组各 6 只。Dap 组予达格列净灌胃治疗 4周后，收集标本进行检测，电镜观察肾脏结构变化，免疫荧光、Western blot 检测相关蛋白表达水平。结果电镜下 Dap 组肾小球区病变轻于 T2DM 组。Dap 组肾重/体重、FPG、FIns、24 h 尿总蛋白、24 hUAlb 低于 T2DM 组（P0.05）。与 Con 组比较，T2DM 组自噬标志物微管相关蛋白轻链 3（LC3-II/LC3-I）比值、自噬同源蛋白（Beclin-1）、足细胞特异标记蛋白（NPHS2）降低（P0.05），Dap 组p-AMPK/AMPK 比值、Beclin-1 蛋白、LC3-II/LC3-I 比值升高（P0.05），NPHS2 降低（P0.05）。与T2DM 组比较，Dap 组 p-AMPK/AMPK 比值、Beclin-1、NPHS2、LC3-II/LC3-I 比值升高（P0.05）。结论达格列净可通过激活 AMPK 途径增强 T2DM 大鼠足细胞自噬发挥肾脏保护作用。【关键词】达格列净；腺苷酸活化蛋白激酶；足细胞；自噬doi：10.3969/j.issn.1006-6187.2023.01.012Researches on Dapagliflozin enhancing podocyte autophagy by activating adenosine monophosphate activited protein kinase pathway XIONG Zhexue，LI Ningxu，TANG Mingjuan.Department of Nephrology，Liyuan Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430000，ChinaCorresponding author：LI Ningxu，Email：【Abstract】ObjectiveTo investigate whether Dapagliflozin can induce podocyte autophagy byactivating adenosine monophosphate-activited protein kinase（AMPK）pathway.MethodsA total of 20male diabetic rats 45 week old were randomly divided into three groups：diabetes group（T2DM，n6），Dapagliflozin group（Dap，n6），and control group（Con，n6）.Dap group were treated with Dapagliflozinfor 4 weeks，and the corresponding specimens were collected and examined after treatment.The changes ofrenal structure were evaluatedby electron microscopy，and the expression levels of related proteins weredetected by immunofluorescence and western blot.ResultsUnder electron microscope，the glomerularlesion was slighterin the Dapagliflozin group than in T2DM group.The ratio of kidney weight to bodyweight，serum glucose，serum insulin，24-hour urinary total protein and 24-hour urinary albumin were lowerin Dap group than in T2DM group（P0.05）.Compared with Con group，autophagy marker microtubule-associated protein light chain 3（LC3-II/LC3-I）protein ratio and autophagy homologous protein（Beclin-1）protein，podocyte marker（NPHS2）protein were decreased in T2DM group（P0.05），while p-AMPK/AMPKratio，Beclin-1 protein and LC3-II/LC3-I ratio were increased and NPHS2 protein was decreased in Dapgroup（P0.05）.Compared with T2DM group，p-AMPK/AMPK ratio，Beclin-1 protein，NPHS2protein and LC3-II/LC3-I ratio were increased in Dap group（P0.05）.ConclusionDapagliflozin canenhance the autophagy of podocytesby activating AMPK pathway and play a protective role in kidney in基金项目：国家重点研发计划基金资助项目（SQ2018YFC200194-02）作者单位：430000 武汉，华中科技大学同济医学院附属梨园医院肾内科通信作者：李凝旭，Email： 53中国糖尿病杂志2023年1月第31卷第1期Chin J Diabetes，January 2023，Vol.31，No.1T2DM rats.【Key words】Dapagliflozin；AMPK；Podocyte；AutophagyDKD 是 DM 常见并发症，也是终末期肾病的主要病因1。肾脏足细胞是维持肾小球滤过屏障功能的关键细胞，其受损缺失导致蛋白尿出现，影响肾脏结构改变及功能丧失。足细胞自噬是一种维持细胞内动态平衡的降解系统，作为一种高分化细胞，在基础水平下表现出高度自噬活性2。自噬受机体营养状态调节，在 DM、肥胖等营养过剩状态下自噬受抑制，在营养剥夺状态下自噬被激活3-5。SGLT2i 直接作用于近端肾小管，减少葡萄糖重吸收达到降糖目的。SGLT2i 对肾脏的保护作用超出其对血糖的影响，尤其是对尿蛋白的缓解6。SGLT2i 使尿液中葡萄糖大量流失，诱导一种与饥饿或营养剥夺相似状态7，可能通过激活能量感受器腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）途径增强肾小管外细胞如足细胞自噬，延缓 DKD 进展，发挥肾脏保护作用。达格列净是一种 SGLT2i 类药物。本研究通过观察 T2DM 大鼠达格列净对肾脏 AMPK 蛋白活化状态、足细胞自噬及相关蛋白表达的影响，旨在探讨 SGLT2i 通过 AMPK 途径增强大鼠肾脏足细胞自噬。材料与方法一、实验材料20 只 SPF 级健康雄性 SD 大鼠，45 周龄，体重 75105 g，购自三峡大学动物实验中心提供SCXK（鄂）2017-0012。高脂饲料（蛋白质 16.4kcal%，脂肪 44.8 kcal%，碳水化合物 39.1 kcal%，总 能 量 4.3 kcal/gm）及 普 通 饲 料（蛋 白 质 10kcal%，脂肪 20 kcal%，碳水化合物 20 kcal%，总能量 3.85 kcal/gm）（SCXQ20190227255，武汉万千佳兴公司）。本研究经华中科技大学同济医学院实验动物伦理委员会审批。达格列净片（国药准字J20170040，英 国AstraZeneca公 司）；STZ（V900890-1G，美国 Sigma 公司）；AMPK 抗体、p-AMPK 抗体（美国 CST 公司）；微管相关蛋白轻链 3（LC3）抗 体、自 噬 基 因 BECN1 编 码 蛋 白（Beclin-1）抗体、足细胞特异标记蛋白（NPHS2）抗体（20384-1-AP）、GAPDH 抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG 抗体（美国 Proteintech 公司）；蛋白浓度检测试剂盒、SDS 制胶试剂盒、DAPI 染色剂（武汉赛维尔公司）。全自动生化检测分析仪（BECKMAN COULTER AU5800）；ChemiDocXRS+成像系统（美国 Bio-Rad 公司）；荧光显微镜（日本，Nikon Eclipse C1）；透射电子显微镜（日本，HITACHI，HT7800/HT7700）。二、实验方法1.DKD 模型构建：20 只 45 周龄 SD 雄性大鼠饲养于标准 12 h 光/暗周期笼中，自由获取食物和水，恒定室温（232），相对湿度（4510）%，随机选取 6 只为空白对照组（Con），剩余 14 只建立 T2DM 模型。Con 组以普通饲料饲养。其余予高脂饲料喂养 4 周，连续 3 d 腹腔注射 STZ 50 mg/kg（溶于 pH4.2 的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液）8-9，注射 STZ 前后 2 周记录大鼠体重、进水量、血糖。1 周后检测 FPG16.7 mmol/L 及观察到明显“三多一少”症状为 T2DM 建模成功，共 12 只。成模后继续予高脂高糖饲料，2 周后随机分为 T2DM组和达格列净组（Dap），每组各 6 只，Dap 组每天17：00 灌胃达格列净 1 mg/（kg d），T2DM 组每天同时灌胃生理盐水 1 mg/（kg d）。治疗 4 周后收集各组 24 h 尿液，麻醉后心脏取血（每只约 3 ml）、摘除肾脏称重。将部分肾组织固定于 10%中性福尔马林中进行组织化学分析，部分肾组织置于 2.5%的戊二醛固定液中行电子显微镜检查。其余肾组织液氮立即冷冻，保存于80。2.生化分析指标：血液及尿液标本于 43000 r 离心 15 min，取上清液送至华中科技大学附属 梨 园 医 院 检 验 医 学 科 全 自 动 分 析 仪 检 测（BECKMAN COULTER AU5800），检 测 FPG、FIns、血肌酐（Scr）、24 h 尿总蛋白（UTP）、24 hUAlb。计 算 胰 岛 素 抵 抗 指 数（HOMA-IR）FPG FIns/22.510。3.透射电镜：处死各组大鼠前准备好电镜固定液，取出新鲜肾脏标本，用手术刀片切割至黄豆大小，转移至装有新的电镜固定液的 EP 管内固定。经过固定、漂洗、脱水、包埋、过夜后制成树脂块，超薄切片机 6080 nm 超薄切片，150 目方华 54中国糖尿病杂志2023年1月第31卷第1期Chin J Diabetes，January 2023，Vol.31，No.1膜铜网捞片，铜网切片放入铜网盒内室温干燥过夜。最 后 透 射 电 子 显 微 镜（日 本，HITACHI，HT7800/HT7700）下观察，采集图像分析。使用Image J 软件（美国，Madison，WI）分别对每组某 1个肾脏截面电镜图的随机 7 个肾小球视野进行肾小球结构参数分析。4.Western blot：使用 RIPA 裂解液与蛋白酶抑制剂 Cock