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不同来源细菌对氟苯尼考的耐药性分析及其 floR 基因传播机制的研究 摘要：目的 本实验主要研究不同来源(包括鸡源、鸭源、牛源、水源、土壤以及虾源）细菌的floR 基因传播情况，了解氟苯尼考耐药性在不同动物源细菌的变迁趋势、生物学特性和耐药谱，对氟苯尼考耐药性进行危险性评估，并从基因水平对细菌氟苯尼考耐药机制进行探讨，从而为耐药性的有效防治和新兽药开发提供参考。方法 本研究通过伯杰细菌鉴定手册第八版并结合16srRNA对细菌进行初步的分离鉴定；按琼脂稀释法对所有细菌进行氟苯尼考等5种抗生素的药物敏感性试验以获得药敏谱；通过脉冲场凝胶电泳（PFGE）进行分子分型确认不同来源的耐药菌的播散情况；通过菌落及基因组和质粒进行PCR扩增筛查floR基因阳性菌株；质粒结合试验检测携带floR基因的耐药质粒的转移性，并获得含有携带floR基因质粒的接合菌，以进一步用酶切和PCR分析携带floR基因的耐药质粒结构；通过PCR反应研究耐药性基因与插入序列、转座子、整合子等可移动元件的关系；对扩增的不同源细菌耐氟苯尼考基因floR进行测序和分析。结果 在206株分离株中，以大肠杆菌最为常见；琼脂稀释法药敏检测氟苯尼考耐药性同PCR方法检测floR基因阳性呈现高度一致性；对整合子Ⅰ的基因研究发现在 通过接合实验获得12株含携带floR基因质粒的接合菌。结论 耐氟苯尼考抗菌药物的细菌检出率较高，常见于耐氟苯尼考的大肠杆菌；且floR耐药基因多以质粒结合和可移动DNA元件进行传播；整合子Ⅰ在介导细菌多重耐药方面有重要作用。 关键词：：细菌；氟苯尼考；耐药性； floR基因传播机制 近年来兽药抗生素在畜禽养殖中大量使用，大部分抗生素未经代谢以母体化合物形式随粪便排出体外，导致抗生素在环境中积累，由此诱导抗性微生物和抗生素抗性基因的产生，对人畜健康构成极大的潜在威胁[?]。其中，因广谱、高效的特性而广泛使用于兽医临床的氟苯尼考（Florfenicol）引起了人们的关注。氟苯尼考已在亚洲、欧洲、美洲等20多个国家上市，主要用于猪、牛、鱼及禽类疾病的治疗[1]。但由于临床使用不当，其耐药菌株的发生率逐年上升，继巴氏杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌等耐氟苯尼考菌株的分离，??检测出了氟苯尼考耐药基因floR [2-4]，甚至在临床上也发现了对氟苯尼考耐药的人源大肠杆菌[5]。耐药性可通过食物链或环境在人与食品、人与人或人畜之间传递，故对人、动物共患病原菌中floR 基因的传播途径和机制的研究就显得十分重要。本课题旨在研究氟苯尼考耐药现状和氟苯尼考耐药基因floR的播散机制，以期为临床科学使用氟苯尼考和减缓耐药菌的产生提供重要依据和参考，也为深入研究氟苯尼考耐药基因floR的传播奠定理论基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1菌株 虾、鸡、鸭、牛等来源的样本及附近河流的水样和土壤样本采样于本地区不同养殖场及其周边。质控菌株ATCC25922购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。 1.1.2 试剂 营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、三糖铁琼脂培养基均购自北京三药科技开发公司；Beef Extract(牛肉浸膏)、Yeast Extract(酵母提取物)、Tryptone(胰蛋白胨)、Dextrose(葡萄糖)等购白Solabio公司；蛋白胨、氯化钠、磷酸二氢钾、琼脂粉、结晶紫、番红、甲基红、草酸铵、二甲基苯甲酸、无水乙醇，氯化钾等均为国产分析纯(AR) 。 1.1.3微量生化发酵管     葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、枸橼酸盐、尿素、硫化氢、明胶等细菌微量生化鉴定管，购自杭州天和微生物试剂有限公司。 1.1.4 主要仪器 EBA21型离心机购自Hettich公司;PCR仪购自Thermo公司；凝胶成像分析系统购自Dinco公司；恒温细菌培养箱购自天津市中环实验电炉有限公司；高压蒸汽灭菌锅购自广州科洋医疗设备有限公司；微量可调加样器购自 Eppendorf公司；ZHWY-2102立式双层恒温摇床购自上海至诚分析仪器制造有限公司；SW-CJ-IF超净工作台购自苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；BS电子分析天平购自北京赛多利斯仪器系统有限公司。 1.2 方法 1.2.1菌株的采集、纯化和鉴定： 从本地区不同的养殖场及附近河流采集鸡、鸭、牛、虾、土壤、水等来源的样本，根据伯杰细菌鉴定手册第八版对已分离出的菌株进行初步生化鉴定，同时结合 16S rRNA 鉴定细菌，并采用特定的培养基，纯化扩增保种。 1.2.2 琼脂二倍稀释法测定最小抑菌浓度（MIC） 用琼脂稀释法测定分离菌种对氟苯尼考等5种常见抗生素的MIC值。将待测菌用无菌生理盐水配置成0.5麦氏单位的菌悬液,然后用无菌生理盐水稀释10倍，用排枪将稀释的菌液移至96孔板中。以多点接种器蘸取制备好的菌液（约1~2μL）接种于抗菌药物平板，菌量约为107CFU/mL。不含药的平板为对照，ATCC25922为质控菌株。待菌液被琼脂吸收后，置于恒温培养箱中，37℃培养 18~24h，观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的最低药物浓度为 MIC 值，结果按美国临床与实验室标准化机构(CLSI)的标准判断[7]。 1.2.3 用脉冲场凝胶电泳 PFGE 对氟苯尼考耐药株的遗传相关性分析： 采用美国 Bio-rad CHEF Mapper XA 脉冲场电泳系统进行分析，每 120 μL 酶切体系中加入 4 μL ApaⅠ 限制性内切酶，37℃酶切过夜。电泳参数为：初始脉冲 5 s，最终脉冲 20 s，电压 6 V/cm，夹角 120(，电泳 20 h。电泳结束后，获取保存图像，使用 BioNumerics software 进行分析，采用 UPGMA 方法对 PFGE 图谱进行聚类分析。 1.2.4 氟苯尼考耐药菌中floR基因调查： 挑取单菌落，进行菌落PCR筛查floR基因，反应体系为30μL，反应程序：94℃ 5 min，94℃ 40 s，55℃ 45 s，72℃ 50 s，35 个循环，72℃ 延伸10 min，4℃ 保温(引物序列见表1）。同时，将培养至对数生长期菌液，用蛋白酶/SDS 法提取各菌株的基因组，碱裂法提取质粒 DNA，根据数据库中的floR 基因的保守序列设全长计引物，扩增floR基因，经PCR产物纯化试剂盒纯化后送桑尼生物有限公司测序，采用 DNASTAR、DNAMAN 等生物学软件，分析氟苯尼考耐药株携带的floR基因的多态性。 1.2.5 氟苯尼考耐药基因floR水平转移机制的研究 （1）floR 基因相关可移动 DNA 元件分析 设计相关可移动 DNA 元件转座子的 PCR 扩增引物，以耐氟苯尼考菌株基因组 DNA 和质粒DNA为模板进行 PCR 扩增并对 PCR 产物进行测序，分析序列的同源性、可移动元件的结构特点及基因盒的组合方式等，确定floR基因与插入序列、整合子、转座子的关系。 （2）对菌株进行质粒接合转移实验 根据药敏试验结果，从携带floR 基因的菌株中选取对氟苯尼考有耐药性的多重耐药菌作为供体菌，以对利福平有抗性的大肠杆菌 E.coliC600 作为受体菌。挑取供体菌和受体菌的单菌落接种于2mL LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜;将供体菌和受体菌的LB液体培养基1:100稀释，37℃振荡培养4h至对数生长期;取供体菌500μL和受体菌500μL等量混合，加入3mL新鲜高压的常温LB液体培养基，混匀后37℃孵育过夜，受体菌和供体菌也同时孵育，以作对照。取 100 µL 菌液均匀涂布于药物选择性平板(氟苯尼考64μg/mL+利福平2048μg/mL)，37℃培养 18-24 h。挑取药物选择性 MH 平板上生长的接合子菌落作菌种鉴定、PCR检测及药敏分析，质粒耐药基因检测floR基因阳性且对利福平与氟苯尼考均耐药的大肠埃希菌为目的菌株。 1.2.6杂交定位分析 根据 PCR 产物测序结果设计相应的探针，southern印迹杂交对携带氟苯尼考耐药基因floR不同来源的细菌进行基因定位。 1.2.7 FloR基因的侧翼序列： 2 结果 2.1 细菌分布情况 试验分离的206株不同来源的细菌，经生化及16sDNA鉴定，如表1所示，主要为大肠杆菌，占50.49%，其次分别为志贺氏菌、气单胞菌、肺炎克雷伯菌等。 2.2 抗菌药物敏感性测试结果 206株不同来源分离株对5种常用兽用抗生素的药敏试验结果表明（表2），全部被检菌株均有不同程度的耐药性，且多重耐药现象严重（占93.2%），其中对５种抗生素全耐药的有103株占50.0％。不同动物来源的细菌对不同药物的耐药情况略有不同（图1），可能与临床使用频率有关。本次试验中筛选出121（58.74%）株耐氟苯尼考菌株（表2），其中鹅来源的耐药最高，达97.37%，并且在水和土壤中也检出了氟苯尼考耐药菌株，可能是由于近些年氟苯尼考在畜禽养殖广泛应用使其在环境中不断的积累造成。 2.3 floR筛查结果 菌落PCR扩增结果（图2）显示floR基因阳性菌株120株，检出率为（55.34%），全部为氟苯尼考耐药菌株。携带floR基因的菌株可以介导的氟苯尼考水平为32-1026ug/mL，与MIC≥32ug/mL的菌株比例基本一致，说明导致动物源性细菌对氟苯尼考低敏感表型的主要分子机制是携带了floR基因。 表1：不同来源细菌生化鉴定结果 表2：不同来源细菌对不同抗生素的耐药结果 四环素 头孢噻呋 氯霉素 氟苯尼考 恩诺沙星 鸡源 97.56% 97.56% 73.17% 70.73% 100% 鹅源 94.74% 94.74% 100% 97.37% 100% 水源 57.89% 57.89% 10.53% 10.53% 100% 土壤 48.28% 89.66% 41.38% 41.38% 100% 牛源 78.26% 60.87% 58.70% 54.35% 100% 虾源 100.00% 100.00% 39.39% 48.48% 100% 大肠杆菌 克雷伯菌 气单胞菌 沙门菌 志贺菌 其他 鸡源 33 0 0 0 5 3 鹅源 27 0 0 2 4 5 水源 4 2 0 0 3 10 土壤 5 2 0 0 3 19 牛源 30 3 0 2 8 3 虾源 5 0 11 0 0 17 总计 104 7 10 4 23 57 图1：不同来源细菌对不同抗生素的耐药结果 图2：PCR产物凝胶电泳图 2.4 PFGE分子分型 利用脉冲场凝胶电泳对本研究中挑取？？株floR基因检测阳性的大肠杆菌及3株肺炎克雷伯菌进行分子流行性调查，其中有？株大肠杆菌未能正常裂解，共得到条有效条带？通过软件进行聚类分析，从图3中可以看出，？株floR基因阳性大肠奸菌可以分为？个簇，大部分菌株的同源性谱型范在？到？之间，细菌多样性程度有不高，说明floR阳性大肠杆菌可能在本地区的动物体内发生了克隆传播的现象。 另外，三株肺炎克雷伯菌中的F03为临床分离的携带floR基因的人源性标本，J03和 p则来源于鸡和土壤，从谱型看相似度极高，同源性达。。。。,说明floR基因可以在人、动物、环境中转播。 2.5 floR基因定位分析 我们根据前期研究中已完成全基因组测序的肺炎克雷伯菌1343的序列，设计探针对floR基因阳性的菌株进行south杂交实验，结果显示floR基因可以定位在大小不同的质粒上，甚至在同一株菌中的大小不同的质粒上检测到了floR基因（图4），具体结构有待进一步分析。 图3 图4 2.6接合试验 根据上述耐药菌和受体菌EC600的氟苯尼考和利福平的MIC值选择46 株含质粒DNA且 floR基因阳性菌进行接合试验，经利福平和氟苯尼考抗性共同筛选，并用PCR和生化指标进行鉴定，结果显示12株菌的质粒接合转移成功，结合子获得了氟苯尼考的抗性（表3），提取结合子的质粒（图5）均可从供体菌中找到来源，说明FloR基因可以通过质粒水平传播。 2.7 FloR基因的侧翼序列 对定位于肺炎克雷伯菌1341的大质粒上的floR基因的侧翼区的序列进行分析，上游有一个转座酶LysR基因，下游有一个TnpA转座子结构（图4），通过与Genback中的核酸序列比对，我们发现该核心区域的侧翼序列和霍乱弧菌17861CE、大肠杆菌078的PT078质粒上的相应序列的同源性均为100％，与肺炎克雷伯菌质粒R55质粒及鲍曼不动杆菌质粒PCCK381的相应序列也有97%的同源性，说明该基因核心区域可能通过转座子的方式插入到了耐药菌的基因序列上，既可以在染色体上也可以在质粒上，加快了floR基因的播散。 表3：12株接合子的耐药情况 四环素 氟苯尼考 氯霉素 恩诺沙星 头孢噻呋钠 利福平 Jg8 <4 512 128 64 32 >2048 Jg9 <4 512 128 64 32 >2048 Jg11 <4 512 64 >2048 >2048 >2048 Jg12 <4 512 128 >2048 >2048 >2048 Jg17 128 256 128 >2048 >2048 >2048 Jg32 <4 512 128 >2048 >2048 >2048 Jh9 128 512 128 >2048 >2048 >2048 Jh25 64 512 128 >2048 >2048 >2048 Jh34 128 512 128 >2048 >2048 >2048 JC19 128 512 128 >2048 >2048 >2048 JC21 128 512 128 >2048 >2048 >2048 JC24 <4 512 256 >2048 >2048 >2048 EC600 <4 <4 16 64 64 >2048 ATCC <4 <4 <4 64 32 >2048 图5：接合子接合前后质粒对比电泳图谱 注： M：Lambda DNA/HindIII Marker；1,3,5,7,9,11：接合前质粒DNA；2,4,6,8,10：接合子质粒DNA 3讨论 氟苯尼考（florfenicol，FFC)是一种白色无臭的粉末状物质，也被称为氟甲砜霉素，它是甲砜霉素（thiamhenicol)的单氟衍生物，是新一代兽用合成抗生素(田丽粉等，2009)，因具有抗菌谱广、吸收良好、体内分布广、无潜在致再生障碍性贫血的副作用和使用安全的特点,作为兽药和饲料添加剂在兽医临床上广泛应用[2]。氟苯尼考在畜牧业中持续、广泛的使用已产生严重的耐药问题。本次调查检测了动物源细菌中氟苯尼考耐药情况，结果表明耐药情况严重，周边环境中细菌 也有较高的耐药性。另外，floR基因与且与MIC≥32的菌株所占的比例相近，与singer等人研究结果一致。 FloR基因最早是由Kim等人首次于在鱼的病原菌发光杆菌亚种上发现的。随后在沙门氏菌、鲍曼不动杆菌、巴氏杆菌、波氏杆菌、克雷伯氏菌和大肠杆菌中发现。该基因能够广泛流行的一个原因主要是由于其常位于可移动元件上，如质粒或转座子甚至基因岛上。Blickwede 等[21]分析了猪源耐氟苯尼考大肠杆菌携带floR 基因的质粒pMBSF1，结果发现floR 基因侧翼序列由3 个不同来源的序列构成，分别与转座子Tn5393、来自E．coli10660携带floR 基因的质粒和转座子Tn1721 具有极高的同源性。本研究结果也显示，FloR基因主要定位在质粒上，但结构有所不同，定位于大质粒上的floR基因上下游含转座子结构。氟苯尼考耐药基因的分子遗传背景非常复杂，耐药质粒在细菌间转移增强耐药菌耐药性的强度、加速耐药性的扩散，而转座作用又将细菌染色体、质粒与噬菌体的耐药基因彼此联系起来,丰富了耐药质粒的来源。 氟苯尼考是九十年代上市的动物专用抗生素，在人医学临床上没有使用，但已有越来越多的人源性耐药株被分离[23]，说明耐药基因可能通过接触、动物性食品加工、食物链等途径传播至人体和环境。我们只有深入了解氟苯尼考耐药基因的产生和传播机制，才能采取有效的措施来阻止抗性基因的传播并防止其在病原微生物中的扩散，客观评价抗生素在环境中的生态风险，从而为合理用药、新药开发、药政管理、公共卫生管理提供科学依据，促进我国动物源细菌耐药性风险评估与防控的开展，保障养殖业发展和食品安全，维护人类健康。