13. EdU染色实验.pptx

细胞功能实验实验技术分享（EdU、TUNEL染色）,/01,EdU染色实验原理,细胞增殖是指细胞在周期调控因子的作用下，通过DNA复制等反应，完成细胞分裂的过程。增殖检测一般是分析分裂中细胞的数量变化，进而反映细胞的生长状态及活性，目前广泛应用于肿瘤生物学，分子生物学，药代动力学等领域。细胞增殖检测的方法众多，应用非常广泛，按检测原理主要分为4 类：检测DNA合成、检测代谢活性、检测细胞增殖相关抗原和检测ATP浓度。其中，细胞DNA合成检测是通过测定细胞的DNA合成量来评价细胞的增殖能力，直接测定DNA合成是检测细胞增殖最准确的方法，它是细胞增殖、细胞周期、DNA修复及分化、信号通路和细胞标记物追踪等研究方向常用方法之一，常用的检测试剂主要是EdU、BrdU等。,BrdU(Bromo-deoxyuridine)法，是在DNA复制过程中，由BrdU代替胸腺嘧啶核苷结合至DNA链，再通过带有标记的BrdU抗体，与DNA链上的BrdU发生抗原抗体反应，通过检测BrdU上的标记信号判断细胞增殖状态的方法。,BrdU(Bromo-deoxyuridine)法，是在DNA复制过程中，由BrdU代替胸腺嘧啶核苷结合至DNA链，再通过带有标记的BrdU抗体，与DNA链上的BrdU发生抗原抗体反应，通过检测BrdU上的标记信号判断细胞增殖状态的方法。,EdU(5-ethynyl-2-deoxyuridine)，是胸腺嘧啶脱氧核苷类似物，在DNA合成过程中，它可替代胸腺嘧啶脱氧核苷，掺入到新合成的DNA中。EdU上的乙炔基能与荧光标记的小分子叠氮化物探针（如FITC Azide、AF系列染料等），在一价铜离子的催化下，形成稳定的三唑环。该反应非常迅速，因此被称作点击反应（Click reaction）。通过点击反应，新合成的DNA会被相应的荧光探针所标记，此时，可以使用荧光检测设备，检测细胞增殖状况。,相较于BrdU法，EdU法具有明显的优势：由于存在空间位阻，BrdU法的大分子抗体很难与DNA链上的BrdU结合。为了使大分子的BrdU抗体与DNA上的BrdU结合，需要对双链DNA进行变性处理（如酸变性、热变性或者DNase消化等）。这种变性可能会影响细胞形态，并影响后续的细胞染色与检测。而EdU法使用的是小分子叠氮化物，空间位阻小，无需对DNA进行变性处理。EdU法无需使用抗体，操作便捷，检测灵敏度高，目前正逐步取代BrdU法，现已被广泛应用于细胞增殖检测。,/02,EdU染色详细步骤,1.小鼠脊髓组织冰冻切片EdU染色,1.1 小鼠脊髓损伤模型建立1.1.1 使用1.25%阿佛丁作为麻醉剂，麻醉剂量为0.2ml/10g，麻醉方法采用腹腔注射（千万不要一次打过多麻醉剂，小鼠麻醉需要一个过程）。将手术器械、碘伏、利多卡因、青霉素、纱布、注射器等放入生物安全柜，紫外线消毒30分钟。1.1.2 取小鼠称重，计算麻醉剂用量（1.25%阿佛丁，0.2ml/10g，腹腔注射）。观察小鼠肢体对痛觉的反应，评估麻醉效果，确认麻醉成功后从头侧至尾侧检查小鼠脊柱，最凸出处为T10椎体，以此为中心，剔除小鼠背部毛发，碘酊消毒1次，酒精脱碘2次，术区铺巾，将小鼠俯卧位置于无菌操作台。1.1.3 沿脊柱走向，用手术刀于T9-T11椎体间纵行切开背部皮肤，紧贴皮下注射利多卡因形成皮丘，减少小鼠痛感，增强麻醉效果；根据结构充分暴露椎旁肌肉及各韧带，直至T9-T11的棘突、椎板清晰可见。用镊子提起T10椎体，剪去棘突，微型咬骨钳沿椎间隙剪去T10椎板，可见白色脊髓，暴露脊髓至最大直径，便于下一步钳夹损伤。1.1.4 脊髓压迫：将动脉夹打开后顺着脊髓两侧间隙伸入，保持脊髓压迫10秒左右，可见脊髓充血但不破损，将小鼠痉挛性摆尾及双下肢、躯体瘫痪作为造模成功标准。1.1.5 术后处理：造模成功后检查止血，逐层缝合肌肉、皮肤；将小鼠放置于加热垫上保温（该步骤很重要，一定要等小鼠可以拖着后腿走路了，再放回笼子里）；术后每天辅助小鼠排尿、排便，防止自噬现象。,1.小鼠脊髓组织冰冻切片EdU染色,1.1 小鼠脊髓损伤模型建立1.1.6 EdU的分子量为252.23，易溶于水，PBS等缓冲液，生理盐水，更易溶于有机溶剂。通常在50mg EdU粉剂中加入20ml PBS溶液，混匀，实验用量为50mg/kg，稀释浓度为 0.5-1mg/mL。小鼠体重20g，需要注射1mg，以1mg/mL计算，需要注射1mL。配置好的试剂放置于4冰箱保存。1.1.7 脊髓损伤造模成功后，立刻对损伤小鼠腹腔注射EdU试剂，注射后观察小鼠存活情况，若存活良好，将小鼠放回笼中。此后每天定时对损伤小鼠腹腔注射 EdU试剂，一直注射到取材当日。（最佳标记时间依据具体实验目的而定，小肠等增殖快的组织宜采用短时间标记(2hr)，大脑等增殖慢的组织及器官宜采用长时间标记）。,1.小鼠脊髓组织冰冻切片EdU染色,1.2 小鼠脊髓组织取材制备（冰冻切片）1.2.1 1.25%阿佛丁腹腔注射（0.2ml/10g），麻醉成功后将小鼠仰卧位固定于灌注台，碘伏消毒，手术剪打开小鼠胸腔、暴露心脏，将注射器插入心尖，使用输液器从心尖部注入生理盐水100ml，排出小鼠体内血液，随后使用50ml 冰冷的4多聚甲醛（PFA）灌注固定，直至小鼠身体僵硬，灌注完毕后小心取出脊髓组织，如果固定效果不佳，先将脊髓组织泡在冰冷的4 PFA里10-20分钟，标本就会硬邦邦的，很好剥离出脊髓。1.2.2 将剥离出的脊髓组织泡在装有4%PFA的离心管中，4度冰箱固定1h。1.2.3 将脊髓组织从PFA中取出，泡入30%蔗糖溶液中，4度冰箱脱水48h。该步骤旨在渗透蔗糖溶液进入样品中，替代细胞内的水分，以保护细胞结构和抗原的完整性。1.2.4 使用OCT（optimal cutting temperature compound，是一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，主要用于冰冻切片的包埋，起到支撑组织的作用）在-20度条件下包埋脊髓组织。将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm）。适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内。当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜。1.2.5 将脊髓组织冰冻包埋后，静置30分钟以上，然后用冰冻切片机切为厚度为20微米的组织切片，切片常温晾干30分钟，-20度冰箱保存备用（实际上，当天做当天切片效果最好）。,1.小鼠脊髓组织冰冻切片EdU染色,1.3 正式开始小鼠脊髓组织冰冻切片EdU染色1.3.1 2mg/mL 甘氨酸（Glycine），清洗 10 分钟。甘氨酸在EdU染色中用于清洗的主要原因是其具有以下特点和作用：1）去除非特异性染色：甘氨酸可以有效去除非特异性的染色。在EdU染色过程中，EdU会与细胞的DNA合成活性结合，形成共价键。为了减少非特异性染色，需要使用甘氨酸清洗来去除未结合的EdU分子，从而减少背景信号。2）保护细胞结构：甘氨酸具有一定的缓冲性质，可以维持适宜的pH值，从而保护细胞结构不受过度处理的影响。3）降低细胞毒性：某些细胞对EdU具有一定的敏感性，过多的EdU残留可能对细胞产生毒性作用。使用甘氨酸进行清洗可以有效降低EdU的浓度，减少对细胞的毒性影响。4）调节反应条件：甘氨酸可以作为反应介质的一部分，调节反应条件，提供适宜的环境，有助于EdU的结合和清洗过程的进行。,1.小鼠脊髓组织冰冻切片EdU染色,1.3 正式开始小鼠脊髓组织冰冻切片EdU染色1.3.2 加入100l(0.5%Triton X-100 的 PBS)脱色摇床孵育 10 分钟,1PBS 清洗。1.3.3 以下部分需要避光处理：严格避光配制Apollo染色反应液，现用现配，具体配方如表1所示；每张切片滴加100L Apollo染色反应液，避光室温孵育30分钟，弃去反应染色液。,1.小鼠脊髓组织冰冻切片EdU染色,1.3 正式开始小鼠脊髓组织冰冻切片EdU染色1.3.4 加入渗透剂(0.5%Triton X-100 的 PBS)清洗 2 次，每次 10 分钟,弃渗透剂。1.3.5 加入一种一抗及二抗：1）清洗脊髓切片时可先将切片放入染色缸中，然后倒入PBS洗涤液，这样可防止脱片；2）加入自制封闭液(3%山羊血清，1%BSA,0.3%Triton-100)处理1小时；3）将封闭液吸除，加入一抗50L，37孵育2小时；4）回收一抗，1PBS缓冲液中洗涤3次，每次5分钟；5）加入二抗50L（现配现用），将切片放在湿盒中避光90-120分钟；6）弃去二抗，放入PBS缓冲液中洗涤3次，每次5分钟。（这一步需要认真洗）1.3.6 加入 100-200L DAPI染核，室温孵育 15 分钟，1PBS 洗 1 次，5 分钟。封片、使用激光共聚焦显微镜拍照，4 度湿润保存，不超过 3 天。,2.小鼠脊髓组织石蜡切片EdU染色,2.1 小鼠脊髓损伤模型建立2.1.1 使用1.25%阿佛丁作为麻醉剂，麻醉剂量为0.2ml/10g，麻醉方法采用腹腔注射（千万不要一次打过多麻醉剂，小鼠麻醉需要一个过程）。将手术器械、碘伏、利多卡因、青霉素、纱布、注射器等放入生物安全柜，紫外线消毒30分钟。2.1.2 取小鼠称重，计算麻醉剂用量（1.25%阿佛丁，0.2ml/10g，腹腔注射）。观察小鼠肢体对痛觉的反应，评估麻醉效果，确认麻醉成功后从头侧至尾侧检查小鼠脊柱，最凸出处为T10椎体，以此为中心，剔除小鼠背部毛发，碘酊消毒1次，酒精脱碘2次，术区铺巾，将小鼠俯卧位置于无菌操作台。2.1.3 沿脊柱走向，用手术刀于T9-T11椎体间纵行切开背部皮肤，紧贴皮下注射利多卡因形成皮丘，减少小鼠痛感，增强麻醉效果；根据结构充分暴露椎旁肌肉及各韧带，直至T9-T11的棘突、椎板清晰可见。用镊子提起T10椎体，剪去棘突，微型咬骨钳沿椎间隙剪去T10椎板，可见白色脊髓，暴露脊髓至最大直径，便于下一步钳夹损伤。2.1.4 脊髓压迫：将动脉夹打开后顺着脊髓两侧间隙伸入，保持脊髓压迫10秒左右，可见脊髓充血但不破损，将小鼠痉挛性摆尾及双下肢、躯体瘫痪作为造模成功标准。2.1.5 术后处理：造模成功后检查止血，逐层缝合肌肉、皮肤；将小鼠放置于加热垫上保温（该步骤很重要，一定要等小鼠可以拖着后腿走路了，再放回笼子里）；术后每天辅助小鼠排尿、排便，防止自噬现象。,2.小鼠脊髓组织石蜡切片EdU染色,2.1 小鼠脊髓损伤模型建立2.1.6 EdU的分子量为252.23，易溶于水，PBS等缓冲液，生理盐水，更易溶于有机溶剂。通常在50mg EdU粉剂中加入20ml PBS溶液，混匀，实验用量为50mg/kg，稀释浓度为 0.5-1mg/mL。小鼠体重20g，需要注射1mg，以1mg/mL计算，需要注射1mL。配置好的试剂放置于4冰箱保存。2.1.7 脊髓损伤造模成功后，立刻对损伤小鼠腹腔注射EdU试剂，注射后观察小鼠存活情况，若存活良好，将小鼠放回笼中。此后每天定时对损伤小鼠腹腔注射 EdU试剂，一直注射到取材当日。（最佳标记时间依据具体实验目的而定，小肠等增殖快的组织宜采用短时间标记(2hr)，大脑等增殖慢的组织及器官宜采用长时间标记）。,2.小鼠脊髓组织石蜡切片EdU染色,2.2 小鼠脊髓组织取材制备（石蜡切片）2.2.1 1.25%阿佛丁腹腔注射（0.2ml/10g），麻醉成功后将小鼠仰卧位固定于灌注台，碘伏消毒，手术剪打开小鼠胸腔、暴露心脏，将注射器插入心尖，使用输液器从心尖部注入生理盐水100ml，排出小鼠体内血液，随后使用50ml 冰冷的4多聚甲醛（PFA）灌注固定，直至小鼠身体僵硬，灌注完毕后小心取出脊髓组织，如果固定效果不佳，先将脊髓组织泡在冰冷的4 PFA里10-20分钟，标本就会硬邦邦的，很好剥离出脊髓。2.2.2 固定：将脊髓组织放入装有4%PFA的离心管中，4度冰箱固定12h。2.2.3 脱水：组织依次经70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水，各30min，再放入95%、100%各2次，每次20min。2.2.4 透明：纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯、各15min。透明后放入小塑料盒子里做好标记。2.2.5 浸蜡：将石蜡融化，温度保持在55左右。一共需要过三遍蜡。因第一次组织含二甲苯过多，第一次浸蜡时间尽可能短约15分钟，后两次可适当延长至30min-1h。该步骤的蜡纯度质量要求不高，但是要注意该步骤石蜡的熔点为54-56。,2.小鼠脊髓组织石蜡切片EdU染色,2.2 小鼠脊髓组织取材制备（石蜡切片）2.2.6 包埋：将组织块放入盛有蜡液的模具中，所需组织切面与底部平行，因蜡液在冷环境中易凝固，此步尽量要快。包埋用的石蜡因为要用于切片，对其质量和纯度和硬度的要求比较高，一般采用徕卡高熔点58-60的片状石蜡。包埋在包埋机上进行，包埋机有60的工作台和-10的工作台，顶部是融化后的徕卡高级石蜡，从出蜡头按压出蜡。取一个金属槽子，加入一些石蜡，然后用镊子将组织固定好，移动到-10的台子上，石蜡很快凝固，组织就固定在里面了，最后盖上做好标记的盖子。放在冷冻台上，约半小时后可以把铁槽取下来。2.2.7 切片：蜡块放置于切片机进行连续不间断切片（3-5微米），切好的片段用毛笔小心转移到40-45的展片台内的清水上，待几分钟后切片完全没有褶皱，选择组织形状完整并且没有刀痕的片子进行捞片，一个片子可以捞上两片。使用黏附载玻片，吸附能力更强。切片保存于4度冰箱，随时可以用。2.2.8 烤片：切片置于65烘箱中60分钟，肉眼可观察到石蜡熔化。2.2.9 脱蜡至水：切片依次按照下列顺序放置进行脱蜡，清洗液/各10分钟，清洗液5分钟，100%无水乙醇95%乙醇80%乙醇75%乙醇各5分钟，PBS洗片3次，每次5分钟。4%PFA 固定 10 分钟，PBS 清洗 2 次，每次 5 分钟。,2.小鼠脊髓组织石蜡切片EdU染色,2.3 正式开始小鼠脊髓组织石蜡切片EdU染色2.3.1 2mg/mL 甘氨酸（Glycine），清洗 10 分钟。甘氨酸在EdU染色中用于清洗的主要原因是其具有以下特点和作用：1）去除非特异性染色：甘氨酸可以有效去除非特异性的染色。在EdU染色过程中，EdU会与细胞的DNA合成活性结合，形成共价键。为了减少非特异性染色，需要使用甘氨酸清洗来去除未结合的EdU分子，从而减少背景信号。2）保护细胞结构：甘氨酸具有一定的缓冲性质，可以维持适宜的pH值，从而保护细胞结构不受过度处理的影响。3）降低细胞毒性：某些细胞对EdU具有一定的敏感性，过多的EdU残留可能对细胞产生毒性作用。使用甘氨酸进行清洗可以有效降低EdU的浓度，减少对细胞的毒性影响。4）调节反应条件：甘氨酸可以作为反应介质的一部分，调节反应条件，提供适宜的环境，有助于EdU的结合和清洗过程的进行。,2.小鼠脊髓组织石蜡切片EdU染色,2.3 正式开始小鼠脊髓组织石蜡切片EdU染色2.3.2 加入100l(0.5%Triton X-100 的 PBS)脱色摇床孵育 10 分钟,1PBS 清洗。2.3.3 以下部分需要避光处理：严格避光配制Apollo染色反应液，现用现配，具体配方如表1所示；每张切片滴加100L Apollo染色反应液，避光室温孵育30分钟，弃去反应染色液。,2.小鼠脊髓组织石蜡切片EdU染色,2.3 正式开始小鼠脊髓组织石蜡切片EdU染色2.3.4 加入渗透剂(0.5%Triton X-100 的 PBS)清洗 2 次，每次 10 分钟,弃渗透剂。2.3.5 加入一种一抗及二抗：1）清洗脊髓切片时可先将切片放入染色缸中，然后倒入PBS洗涤液，这样可防止脱片；2）加入自制封闭液(3%山羊血清，1%BSA,0.3%Triton-100)处理1小时；3）将封闭液吸除，加入一抗50L，37孵育2小时；4）回收一抗，1PBS缓冲液中洗涤3次，每次5分钟；5）加入二抗50L（现配现用），将切片放在湿盒中避光90-120分钟；6）弃去二抗，放入PBS缓冲液中洗涤3次，每次5分钟。（这一步需要认真洗）2.3.6 加入 100-200L DAPI染核，室温孵育 15 分钟，1PBS 洗 1 次，5 分钟。封片、使用激光共聚焦显微镜拍照，4 度湿润保存，不超过 3 天。,细胞EdU实验,药物处理根据实验需要进行各种药物处理。1用无血清神经培养液按1000:1的比例稀释EdU溶液，制备适量50M EDU培养基；2将细胞悬液接种在共聚焦培养皿（中间小皿面积等于96孔板面积）中，共聚焦培养皿每孔加入200ul 50M EdU培养基孵育24小时，弃培养基；,我推荐的试剂：,试剂A EdU溶液,1000X,20uL产品编号:C00003 锐博Cell-Light EdU Apollo555 In Vitro Kit(100T)锐博,3PBS清洗细胞2次，每次5分钟。3.细胞固定化8.每孔加入50ul 细胞固定液(即含4%多聚甲醛的PBS)室温孵育30分钟，弃固定液；9.每孔加入50ul 2 mg/mL 甘氨酸，孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液；10.每孔加入100ul PBS，清洗5分钟，弃PBS；11.每孔加入100ul渗透剂(1%TritonX-100的PBS)孵育20分钟；PBS清洗1次，5分钟。4.Apollo染色,12.每孔加入100 ul的1X Apollo染色反应液（表3），避光、室温、孵育60分钟后，弃染色反应液；13.加入100 ul渗透剂(1%TritonX-100的PBS)清洗2次，每次10分钟，弃渗透剂；5.DNA染色14.每孔加入100ul DAPI，避光染色15分钟后吸出。1PBS洗1次，每次5分钟；激光共聚焦显微镜下观察表达红色荧光的EDU及蓝色荧光的细胞核（DAPI）荧光共染情况，并在蓝色激发光405nm、红色激发光594nm，并固定曝光时间下摄取图片，摄取后通过Image J软件进行分析。6.图像获取及分析建议染色完成后立即进行观测；如果条件限制，请避光 4 湿润保存待测，但不应超过3天。若为细胞爬片或涂片，可使用抗荧光淬灭封片剂封片后4 保存及进行检测。,/03,EdU染色试剂耗材,试剂耗材介绍,试剂耗材介绍,/04,EdU染色避坑指南,避坑指南1.计数时需计数染色信号与核染色信号完全重合或者与核重合信号明显强于胞浆的信号，这是真正的阳性信号。2.为减少背景干扰，洗涤次数和时间都要足够。3.调试共聚焦显微镜拍照时，尽量将曝光时间控制在 30 ms，尽量 1s，以免过曝影响实验准确性。4.染色反应液现用现配，需严格按照顺序和比例配制，否则可能无法有效进行共价反应，若出现试剂颜色变化，则说明该组分可能已失效，应当弃用。反应液配制后尽快使用，最好 15 分钟内使用。5.EdU 试剂盒法含荧光染料，注意和其他荧光染料的不相容性。,