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氟苯尼考耐药机制研究进展 摘要 从海洋生物中寻找高效、低毒副作用的抗肿瘤药物是近年天然药物研究的新领域。藻蓝蛋白是螺旋藻中的一种光合色 素蛋白，具有抗肿瘤、抗氧化、抗突变、抗病毒、增强免疫力、清除自由基和保肝、降血脂等多种生物学功能，有重要的开 发利用价值。现对藻蓝蛋白的抗肿瘤作用及其相关机制做一综述，为天然药物新领域研发和新药开发提供相关依据 关键词 氟苯尼考 flor基因 耐药性 传播机制 抗生素 在目前国内的畜禽水产养殖条件下，抗生素滥用现象十分严重，导致细菌的耐药性不断加剧和蔓延，耐药菌株不断出现，由此带来的耐药问题、环境问题、食品安全问题及公共卫生问题也越来越严重[2]。氟苯尼考是氯霉素的氟化衍生物, 是上世纪九十年代上市的动物专用抗生素,因具有抗菌谱广、吸收良好、体内分布广、无潜 在致再生障碍性贫血的副作用和使用安全的特点, 可用于各种革兰氏阳性和阴性菌感染。临床上主要用于治疗和预防畜禽由巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌及霉形体引起的呼吸道疾病，也可用于控制敏感菌引起的鱼虾疾病，作为兽药和饲料添加剂广泛应用。但由于临床使用不当,其耐药菌株的发生率逐年上升,这已引起了人们的高度重视,相关的研究报道也不断出现。Kim、Lance 和 Keyes 等相 继报道了从巴氏杆菌、沙门氏菌和大肠杆菌等病原菌分离到了耐氟苯尼考菌株并分别克隆到了其耐药基因 flor[55-57]。近年来，鸡源、牛源和猪源大肠杆菌的耐氟苯尼考 flor 基因也相继报道[58-63] 大肠杆菌氟苯尼考耐药性在不同动物间的传播研究. 。最近有报道称，临床上发现了对氟苯尼考耐药的人源大肠杆菌[3],人源沙门氏菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等，表明细菌的耐药性能够在不同动物（包括人类）之间进行传播。 本文将近年来有关氟苯尼考的研究进展特别是其耐药性作一综述，以期探究应对其耐药性的传播可所采取的一系列有效方法、预防和控制措施。 细菌对氟苯尼考的同系物氯霉素和甲砜霉素产生耐药性的机制目前已较为清楚：一是通过caT 调控合成乙酰化转移酶使氯霉素和甲砜霉素转化为无抗菌活性的代谢产物；另一种机制与 cmlA 基因有关，在该基因的调控下能使菌体通过泵出机制使药物在菌体内聚集减少。但是，研究表明耐药基因 caT 和cmlA 都位于质粒上，与细菌对氟苯尼考的耐药性均无直接关系[13]。然而，在 1996 年，日本的 Kim等人[14首次从鱼的巴氏杆菌质粒中发现耐氟苯尼考的基因并克隆测序将其命名为 pp-flo。随后，Bolton [15]、Arcangioli[16]相继从沙门氏菌、大肠杆菌病原菌中克隆得到耐氟苯尼考的耐药基因 floR，其序列分析表明，它和cmlA 基因存在 50﹪的同源性。从牛致病性大肠杆菌中分离的 floR 基因的承载质粒 命名 为pCCK381[17]，从猪致病性大肠杆菌中分离出的floR基 因 的 承 载 质 粒 命 名 为 pMBSF1。 质 粒 pMBSF1 是目前分离的携带 floR 基因的最小质粒，它的 floR 区域与从牛大肠杆菌中分离的不同。研究表明此质粒具有染色体整合位点，进一步分析显示，floR 基因是泵出蛋白 MF 超家族的一员[18]。 最近已有学者从被感染小牛的鼻腔液中分离出一种编码抵抗氟苯尼考和氯霉素的新型缓慢葡萄球菌基因 fexA，携带此基因的质粒命名为pSCFS2。分析表明，fexA 基因的上游区域与氯霉素诱导的葡萄球菌属 caT 基因和 cmlA 基因具有显著的同源性。研究表明 FexA 蛋白代表一种非常典型的氟苯尼考/氯霉素输出系统，但它与FloR 蛋白子群和 CmlA蛋白子群有明显的不同 7 1氟苯尼考研究进展 氟苯尼考（florfenicol）又称氟甲砜霉素，是美国先灵- 葆雅（Schering- Plough）公司于 1988 年研 制成功的一种新型兽医专用氯霉素类广谱抗菌药，其化学名称为 D（+）- 苏- 1- 对甲砜基苯基- 2- 二氯乙酰氨基- 3- 氟丙醇。它具有抗菌谱广、吸收良好、体内分布广、安全高效、耐药性发生率 低等特点，对敏感菌所致的畜禽细菌性疾病治疗效果显著。目前，已在亚洲、欧洲、美洲等 20 多个国家上市，主要用于猪、牛、鱼及禽类疾病的治疗。我国现已通过该药的审批，生产的剂型 有水针剂、溶液和散剂等。 在兽医临床上的应用在国内,氛霉素的新型替代物)氟苯尼考于1999年被批准上市"氟苯尼考结构的修饰使得氟苯尼考在安全性和有效性方面比氯霉素具有明显的优势(smas1995),氟苯尼考抗菌作用强, 毒副作用小的优点使其显示了广阔的市场应用前景"九十年代以来,氟苯尼考已开始逐渐在全球 范围内使用,目前已在日本!欧盟!美国等国家注册上市"由于其广谱性,可用于各种革兰氏阳 性和阴性菌感染"临床上主要用于治疗和预防畜禽由巴氏杆菌!脚膜肺炎放线杆菌及霉形体引起 的呼吸道疾病,也可用于控制敏感菌引起的鱼虾疾病" 氟苯尼考用于治疗鱼的细菌性疾病疗效显著"试验表明,氟苯尼考用来治疗鲜鱼疖病的疗效 明显优于氟甲哇!磺胺啥陡/甲氧节陡(Nodrmo1994)"氟苯尼考用来治疗黄尾鱼的假结核性巴 氏杆菌同样具有良好的疗效(Y玫sungaal998)" 氟苯尼考对放线杆菌引起的猪胸膜肺炎,由巴氏杆菌引起的鸡!牛呼吸道疾病的疗效也明显 牛源大肠杆菌_型整合子的调查及对氟苯尼考耐药性的研究_杜向党.caj 优于许多种常用抗菌药物" 理化性质纯品氟苯尼考为白色或类白色结晶粉末,无味,密度为1.68留cm3"氟苯尼考 微溶于水,其在水中溶解度为1.329几(25e!pH=7),易溶于乙睛!甲醇和丙酮 等有机溶剂"氟苯尼考的辛醇一水分配系数Kow较小,仅为2.36(logKow=0.37), 属于极性有机物" 近岸养殖区中氟苯尼考环境行为的研究_户江涛.caj 1.3.1 氟苯尼考研究现状 氟苯尼考的抗菌机制氟苯尼考有着广谱的抗菌活性,对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性 细菌均有效"较氯霉素,氟苯尼考对一系列范围内的临床细菌分离株在较低水平上更为有效 (s州"卯uluoetal.1981),尤其对多杀性巴氏杆菌!胸膜肺炎放线杆菌!肺炎霉形体和链球菌的作 用效果更好"它也是细菌静止期抑制剂,通过与细菌705核糖体的505 亚基结合,抑制蛋白质合成所需的关键酶)肤酞转移酶,从而特异性地阻止氨基酞与核糖体上的受体结合,抑制肤链的延长而使菌体蛋白不能合成(syriopouluoetal.1981;cnnanol更沁)" 牛源大肠杆菌_型整合子的调查及对氟苯尼考耐药性的研究_杜向党.caj 1.3.2 氟苯尼考耐药机制 就目前来说，对 flor 基因贡献氯霉素和氟苯尼考的机制的理解还不够完善，一般认为它是通过一个非酶外输泵来发生作用。此推测是基于早期的一项关于氟苯尼考体外抗菌活性的研究[64] ，试验显示，氟苯尼考因缺乏 3’羟基而不被氯霉素乙酰转移酶水解。Aoki 和 Kim 发现pp-flor基因推导的氨基酸序列含有大约 70%的疏水氨基酸残基，与负责贡献非酶氯霉素药性的疏水多肽 cmlA 存在 47.4%的同源性[66,67] 。现已知道，氟苯尼考对编码氯霉素乙酰转移酶或氯霉素泵的耐药株仍然具有活性。Arcangioli 和 Kim 也提示预测的 flor 基因的疏水肽可能是与氟苯尼考（和氯霉素）有作用的一个膜蛋白[64,65] 。接下来关于 flo 基因的研究显示，预测的 Flo 蛋白的氨基酸序列几乎与 pp-flo 推测的序列相似[66]。Flo 蛋白与源于铜绿胞杆菌的 cmlA 蛋白存在着 48%到 57%的相似性 [67,68] 。Arcangioli 等对 Flo 蛋白和 cmlA 蛋白的疏水性进行了分析，结果显示，Flo 蛋白和cmlA 蛋白存在着 12 个可能的疏水跨膜区[69]。Flo 蛋白和 cmlA 蛋白存在着共同的保守基序提示 Flo 蛋白可以划分为与 cmlA 蛋白同属一组的 12 跨膜片段（transmembrane segment，TMs）外输泵家族[70] 。 结语 广泛使用抗生素造成世界范围内耐药菌株迅速增加,导致抗生素效力逐渐下降甚至对某些病原菌束手无策,尤其是多重耐药菌引发的感染难以治疗,给畜牧业发展和人类健康带来了严重的潜在威胁 这些问题都与我国畜禽生产和人类公共卫生密切相关,有必要开 展和深入这方面的研究"同时了解细菌耐药性的产生与发展,搞清细菌耐药性机制,对于开发 抗菌新药,合理用药以提高抗耐药菌感染疗效和控制细菌耐药性发展均具有重要意义" 氟苯尼考因其具有抗菌谱广、吸收良好、体内分布广及无潜在再生障碍性贫血的不良反应等优点，在兽医临床中广泛用于预防和治疗动物细菌性疾病。 自 1990 年首次在日本上市至今，氟苯尼考在兽医临 床上的使用已超过 20 年，为保障畜牧业和水产养殖 业的健康发展作出了重要贡献。与此同时，由于氟苯 尼考的广泛持续和不合理使用，很多细菌都获得了对 氟苯尼考的耐药性。研究表明，细菌主要通过酶的水 解、主动外排作用、作用靶位点结构改变介导对氟苯 尼考的耐药。由于大多数氟苯尼考耐药基因都位于 可移动的质粒中，通过转座重组或非常规位点重组的 方式转移进新宿主染色体或质粒，使新宿主获得对相 应抗生素的耐药性。随着各国之间合作交往不断深 入，氟苯尼考耐药菌可通过动物性食品的进出口和人 们的旅游在全世界范围内传播。此外，氟苯尼考在宠 物上的使用也有助于氟苯尼考耐药菌在人和动物之 间的传播。对氟苯尼考耐药性的持续监测及进一步 深入研究其耐药机制和传播机制，将为临床科学使用 氟苯尼考、减缓耐药菌的产生提供有价值参考。 癌症是严重危害人类健康的主要疾病之一，攻克癌症一直是世界瞩目的研究课题。藻蓝蛋白从海洋生 物蓝藻中提取，资源丰富且其无毒安全，其本身已作为营养保键食品为人们利用，故如能用于临床，病人 更易接受。已有越来越多的研究表明，藻蓝蛋白对肿瘤细胞有细胞毒性作用，在人类防癌抗癌的斗争中， 藻蓝蛋白的药用价值将进一步体现。 Reference 1 藻蓝蛋白的活性研究 1.1 藻蓝蛋白可提高机体的抗辐射能力 能够有效抵抗紫外线和其他电离射线辐射是蓝藻的一个重要生物学属性。藻蓝蛋白是蓝藻的主要活性 成分之一，它能显著抑制血细胞的减少，而造血干细胞的损伤或修复在造血功能型辐射疾病中有至关重要 的作用。藻蓝蛋白能降低造血干细胞的光敏感性，防止干细胞减少，促使细胞进入增殖状态，有助于造血 功能的恢复。小鼠体内试验表明，腹腔注射藻蓝蛋白能显著缓和辐射引起的鼠外周血核骨髓细胞的损伤， 加速鼠外周血白细胞、骨髓核细胞和多功能造血干细胞的修复。用 60Co γ- 射线照射注射过藻蓝蛋白的小 鼠，能观察到 C-藻蓝蛋白核多糖参与的白细胞和骨髓成核细胞的损伤修复。藻蓝蛋白能显著降低60Co γ- 射 线照射和腹膜盐酸苯脱注射联合处理所致的小鼠贫血水平[3]。 1.2 藻蓝蛋白具有抗氧化、抗炎症的功效 研究表明，藻蓝蛋白是一种有效的抗氧化剂，具有清除自由基和抗炎症的功效，对大肠炎、关节炎、 葡萄糖氧化酶诱导的炎症以及急慢性组织器官炎症都有显著抑制作用[4]。在各种体外和体内实验模型中， 藻蓝蛋白通过清除羟基、烷氧基和过氧化物等活性氧物质来实现抗炎症活性。进一步的研究表明，抗炎症 活性并不依赖于皮质昌类物质的释放。藻蓝蛋白能抑制 Fe3+-抗坏血酸维生素 C 诱导的过氧化反应。口服 藻蓝蛋白提取物（50-300mg/kg）可显著抑制过氧化反应[5]。 1.3 藻蓝蛋白促进机体免疫系功能和抑制溶血 体内小鼠模型试验表明，藻蓝蛋白可促进小鼠粒单系祖细胞的分化生长，从而提高小鼠机体的免疫功 能。另外，藻蓝蛋白还具有抑制溶血的功效。其抑制溶血的作用方式与维生素衍生物和抗坏血酸维生素 C 相似，不同的是藻蓝蛋白的抗氧化能力要强得多（17-20 倍）。这种保护作用可能是由清除水相中相关基团 引起的。利用 CFU-E（eolonyformingunit-erythroid） 技术体外培养小鼠胚胎肝脏细胞，相继的研究证实 C-藻蓝蛋白和多糖能影响特定的造血祖母细胞的分化和增殖，但具体的机制还不清楚。 1.4 抗肿瘤活性研究 藻蓝蛋白不仅可以在体外抑制肿瘤细胞的生长，而且还在体内小鼠肿瘤模型试验上证实了其抗肿瘤效 果。章申峰[6]报道较高浓度（>40µmol/mL）的 C-PC 可在体外显著抑制肺腺癌 SPC-A1 细胞的生长，并 具良好的时间剂量关系。张成武[7]等运用半固体琼脂培养法和 MTT 检测螺旋藻藻蓝蛋白对人血癌细胞株 HL-60、K-562 和 L-937 生长的影响，结果显示螺旋藻藻蓝蛋白对这 3 种肿瘤细胞均有不同程度的抑制作 用，并存在浓度剂量效应，高浓度抑制作用强。关燕清等[8]还研究了光固定化藻蓝蛋白对体外肝癌细胞 7402 的抑制作用，实验表明，初始固定藻蓝蛋白浓度为 20μg/well 时，对 7402 细胞的抑制率达到 55%，浓度继 续升高，对癌细胞的抑制率反而下降，当藻蓝蛋白浓度高达 0.5mg/well 及 1mg/well 时抑制率又回升到 55%、 66%。体内小鼠肿瘤模型试验显示，经藻蓝蛋白喂食过的患有肺癌的小鼠的存活率显著高于对照组（未喂 食藻蓝蛋白）：6 周后处理组的存活率为 90%，对照组仅存活 25%，8 周后，处理组还有 25%存活，而对照 组全部死亡。 2 藻蓝蛋白的抗肿瘤机制 2.1 诱导肿瘤细胞凋亡 研究表明肿瘤的发生更多是细胞凋亡受到抑制的结果，细胞凋亡是细胞受基因调控的程序性死亡，有 文献报道[9,10]有大量基因可促进或者抑制细胞凋亡发生，一类为促凋亡基因，如 p53 抑癌基因、促凋亡基 因 Fas、核转录因子 NF-kB 和 c-myc 癌基因等基因，另一类为抑制凋亡基因，如 Bcl-2 基因家族。 （1）通过活性氧自由基促进凋亡：Bobbili 等[11]研究发现藻蓝蛋白介导的细胞凋亡是通过活性氧自由 基的产生进行的，自由基消除剂能够抑制藻蓝蛋白介导的 AK-5 肿瘤细胞的凋亡。Bcl-2 转录的 AK-5 肿 瘤细胞对于藻蓝蛋白介导的细胞凋亡有抑制作用，Bcl-2 过度表达能抑制藻蓝蛋白处理过的 AK-5 肿瘤细 胞活性氧簇产量，这证明藻蓝蛋白参与介导 AK-5 细胞的细胞凋亡，它通过调节自由基表达进行抑制。 （2）通过促进 CD59 基因表达促进凋亡：CD59 为补体调节蛋白，与创伤、免疫和肿瘤的发生关系 密切，能很好地保护血液细胞。李冰等[12]发现不同剂量的藻蓝蛋白对含有 CD59 基因的 Hela 细胞具有抗 肿瘤作用，藻蓝蛋白能够促进 CD59 蛋白的表达并减慢 Hela 癌细胞的再生，且作用效果与藻蓝蛋白的含 量有关，二者呈正相关。藻蓝蛋白的 β 亚基具有抗癌作用[13]，能够通过增加细胞凋亡关键酶 caspase-3 和 caspase-8 活性来激活细胞凋亡信号，使细胞发生不可逆转的死亡。 （3）通过抑制 COX-2 活性促进凋亡：环氧化物酶-2（COX-2）在炎症和肿瘤细胞中表达较高，COX-2 抑制剂可抑制肿瘤细胞的生长和肿瘤血管的生成，从而诱导细胞凋亡。研究表明[14]，藻蓝蛋白通过选择性 抑制 COX-2 活性达到促进肿瘤细胞凋亡的作用。 （4）通过影响细胞色素 C 表达促进凋亡：Subhashini 等[15]认为藻蓝蛋白能够诱导慢性白细胞系 K562 凋亡，使线粒体中的细胞色素 C 释放到细胞质中，DNA 修复酶 PARP 裂解，同时 Bcl-2 表达下 降从而诱导细胞凋亡。Miroslav 等[16]发现藻蓝蛋白在人肝癌细胞介导的光动力疗法中可以有效抑制肝癌细 胞 HepG2 增殖，微囊藻蓝蛋白定位于线粒体，可以诱导活性氧积聚，导致线粒体损伤，线粒体细胞色素 C 释放到细胞质中，活化 caspase-3 并使细胞停留在 G2/ M 期，导致细胞凋亡，这种凋亡有可能与线粒体释 放细胞色素 C 及 Bcl-2 表达有关。 2.2 抑制肿瘤细胞增殖 章申峰[6]报道较高浓度（>40 µmol/mL）的 C-PC 可在体外显著抑制肺腺癌 SPC-A1 细胞的生长，并 具良好的时间剂量关系。1995 年蔡心涵等[17]采用不同浓度藻蓝蛋白液处理人大肠瘤细胞株 HR834 作体内 外激光治癌试验，发现癌细胞存活率随藻蓝蛋白浓度降低而递增，呈良好的浓度剂量效应，并具有一定的 杀伤作用。王勇等[18]研究藻蓝蛋白对体外培养 HeLa 细胞的生长抑制作用，发现随藻蓝蛋白剂量的增加， 抑制率逐步提高，而采用流式细胞技术检测 HeLa 细胞，进行周期分析，初步认为这种抑制机制为藻蓝蛋 白使 HeLa 细胞由合成期（S）或分裂期（M）向 G1 期转变和积聚，细胞 DNA 合成衰减，即通过阻止 DNA 的增殖来抑制肿瘤细胞增殖。 2.3 增强机体免疫力 1988 年，哈佛医学院的 Schwarta 和 Shklar 研究发现螺旋藻藻蓝蛋白对一些癌细胞有抑制作用，推 测可能与改善机体免疫功能有关。在国内，李冰[19]建立 S180 荷瘤小鼠动物模型，腹腔注射 C-PC，11 天 后通过 QHS、ELISA、MTT 等试验从免疫器官、免疫细胞、免疫分子水平上检测 C-PC 的抗肿瘤免疫效 应。结果显示，C-PC（处理）组小鼠瘤块直径及瘤体重量小于对照组，而且 T 细胞、B 细胞活性及体液 抗体量显著大于对照组，C-PC 高剂量组比低剂量组抑制肿瘤细胞生长和提高机体免疫力的作用更明显， 从而揭示藻蓝蛋白的体内抗肿瘤作用与机体免疫系统免疫功能的调节有关。 2.4 抗氧化作用 肿瘤的发生、发展和转移与宿主的自由基水平及代谢有关，当肿瘤发生时，氧自由基的代谢失衡，脂 质过氧化反应增强，这也是活性氧诱发肿瘤形成的中间机制之一。SOD 是有效清除超氧化物阴离子自由 基的一类重要的抗氧化酶，阻止由 O2 - 启动的自由基链锁反应[20]。SOD 的活力反映了机体清除氧自由基 的能力。孙国艳等[21]实验表明藻蓝蛋白的补充可以降低 MDA 的水平和红细胞溶血度，增强体内的抗氧化 能力，使自由基对脂质的氧化作用减弱。Bobbili 等[11]研究发现藻蓝蛋白介导的细胞凋亡是通过活性氧自由 基的产生而进行的，自由基消除剂能够抑制藻蓝蛋白介导的 AK -5 肿瘤细胞的凋亡。Bcl-2 转录的 AK -5 肿瘤细胞对于藻蓝蛋白介导的细胞凋亡有抑制作用，Bcl -2 过度表达能抑制藻蓝蛋白处理过的 AK-5 肿瘤 细胞活性氧簇产量，这证明藻蓝蛋白参与介导 AK-5 细胞的细胞凋亡，它通过调节自由基表达进行抑制。 2.5 藻蓝蛋白的光动力学抗肿瘤作用 光动力治疗（Photodynamic therapy，PDT）是在治疗肿瘤和非肿瘤性疾病中的一种有前景的治疗方法 [22]，利用光敏剂将光线集中在癌细胞病灶部位，产生自由基和活泼态氧，从而起到杀伤肿瘤细胞的作用。 采用藻蓝蛋白介导的光动力疗法对小鼠 HeLa 细胞瘤及乳腺癌治疗的免疫和凋亡机制进行的相关研究[23]， 发现藻蓝蛋白介导的光动力疗法能增强小鼠机体免疫力和促进免疫细胞上的配体 FasL 与 Fas 结合，通过 激活 Caspase 启动 HeLa 细胞内的凋亡信号转导通路诱导细胞凋亡，从而抑制肿瘤生长，藻蓝蛋白可以 作为一种光敏剂启动乳腺癌细胞内的凋亡信号转导诱导细胞凋亡。周桃等[24] 制备的聚乙二醇（PEG）修饰 的藻蓝蛋白亚基脂质体（PEG -PCS –lip）对乳腺癌细胞的生长具有抑制作用，PEG 能够增强 PCS 在肿瘤 细胞聚集的靶向性，提高光动力学疗效。 3 结语 癌症是严重危害人类健康的主要疾病之一，