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标书写作标书写作-立意篇立意篇 科学假设是基金的灵魂科学假设是基金的灵魂 最近两周，找酸菜讨论基金的朋友越来越多，这不得不令我意识到一个现实，匆忙的 2014自创业以来，以半年为一周期，一直发生着日新月异的蜕变，坦率讲我不敢保证到了明年这个时候，还能有时间给大家整理基金攻略，所以趁现在还有心境，多传递一点是一点。接下来一段时间，酸菜会专注于把自己对国自然的微末理解分享给大家，相信这几期的内容坚持看下去，会对经历中的小伙伴有所裨益。在写基金的前两年，我一度不理解什么是科学假设（科学假说），也没想清楚科学假设对于一份国自然基金标书的提纲挈领作用。如今回想那个阶段虽然也可以完成标书，但说服力只有及格的水平。大概在 2011 年我开始尝试在申请书中明确提出科学假设，以应对评审在这方面的关注，实操了几例便有了开悟的感觉。科学假设与标题一样，集中反映了课题核心内容，仅从科学假设入手，就能揣摩出课题的创新性、逻辑性和申请人对国自然的熟悉程度。这是我大量研究基金委网站上中标标书的题目，从而掌握国自然内容偏好性之后又一项重要发现，正所谓“假设明确，思路不乱”。以科学假设为准绳，我们能够很容易分辨哪些内容是论述所必需的，而哪些是冗余的；哪些前期工作是立论必要的证据，而哪些可以一笔带过。标书的逻辑性以及行文的一气呵成体现在所有章节都为科学假设而服务，所以这个关键点没有搞定之前，空谈如何写标书只会误入歧途，这也是很多申请人容易犯的一个普遍性错误。既然建立科学假设是撰写自然科学基金标书的第一步，那么我们就需要了解什么样的科学假设是符合国自然标准的，对症下药才能药到病除。一个符合国自然评审口味的科学假设一般是这样的：在某临床问题所对应的科学问题中，靶标分子 X 通过介导 Y 通路（分子）产生 Z 效应。在结直肠癌肝转移（临床问题）的 CTC 中（循环肿瘤细胞，科学问题），X 基因通过介导WNT 通路产生促进肿瘤细胞穿过血管壁的效应作用。进一步凝练成题目 X 介导 WNT 通路在肠癌肝转移 CTC 调节血管侵入中的分子机制。怎么样？跟你查到的那些中标基金的题目是不是很像？详细解说 你会发现，论文中的某一领域在基金的假设中延伸为某临床问题及其对应的科学问题，这是因为你申报的是医学部的基金，言必谈临床意义，所以课题都以临床问题的解决为出发点。而文献很多是基础科研工作者所做，并不一定需要上升到临床层次。科学部的基金写作其科学假设就不需要这种拓展了，临床问题高屋建瓴是咱们医学部的特色。肿瘤转移复发是一个临床问题，而其中循环肿瘤细胞 CTC 的作用就是解释转移发生的一种机制，是一个科学问题，因此你可以把科学问题理解为认识临床问题的不同维度，就像最近大热的电影星际穿越中五维空间对于四维空间的认识那样。一个小小空间中的所有时间都可以实体化为一个可视的片段，同样，一个转移的临床问题，也能够从 EMT、细胞骨架、干细胞、CTC、免疫微环境等多重角度进行解析，我们只需找到适合自己的那一维即可。科学问题不可过大，一项基金只要在一个点上做出突破。靶标分子 X 可以是基因、RNA、非编码 RNA 或是蛋白等，选什么分子类型并不关键，但一定需要具备扎实的前期工作且拥有显著的创新性。经常有朋友咨询他的课题设计靠不靠谱，绝大多数对所选研究目标分子都缺乏自信。我总是会反问：这个分子前期工作发表过相关文章吗？其次是创新性怎么样，在这个领域有没有独立的研究发现？如果是看完文献一拍脑袋想出来的，既没有前期基础又谈不上创新性，就不要拿来丢人现眼了。很多小伙伴看别人做长链非编码 RNA，自己也非得凑上去，殊不知没有前期基础就是死路一条。但另一种情况，前期发了文章，但靶标分子报道很多，新颖性不足怎么办？酸菜也给一个具体建议：你一定需要一个新颖的科学问题，所谓老瓶装新酒，难说完美但滋味还是不同的。“效应”（功能）是理解基金科学问题的更小维度，一个 CTC 可以从不同的细胞表型切入，根据课题需要有选择地设计，因为没遇到过特别困扰的情况，就不赘述了。倒是为什么国自然必须有通路机制有 N 多人吐槽，对医生而言，这实在是一个不讨人喜欢的领域。然而凡事都有规矩，下象棋你不能把象走过河吧，在单位要听领导的吧，所以还是从自身找原因，避不开就去适应它。分子机制一般涉及两个方面：靶标分子 X 能够调控什么信号通路，或被其调控；靶标分子 X 与什么分子存在相互作用，即找到作用靶点，从效应分子的功能上再进一步理解X 的作用方式。其他不必纠结过多，上述两点是经常在课题中涉及的，选一个方向精益求精吧。在酸菜基金培训班上我讲过一句话：有了科学假设，会写立项依据，世界就清净了！在我眼中只有这两样是活的，而其他内容都是八股文，不存在难点。今天解构了科学假设，下期咱们继续来剖析立项依据的写法，有任何想让酸菜讲的关于基金的种种请直接给解螺旋留言。关于基金科学假设中机制设计的讨论关于基金科学假设中机制设计的讨论 一封读者来信 关于科学假设模版，对于分子机制的设计你们似乎非常强调明星分子或通路，但目前与某表型相关的明星通路不止一个，每一通路上的分子也很多，那应当如何选择呢？另外，明星通路只是研究某表型调控较为热门的一些通路，从机制研究本身来说，我们研究的某一靶标分子未必通过这些明星通路发挥功能，也有可能通过一些较为冷门的通路调控其表型吧？还有，你怎么知道该靶标分子不是通过既往未发现的全新通路或机制而发挥功能呢？这种思路是否会错失某种全新重大机制途径的发现机会？呵呵，不好意思扯远了，回到标书写作，我意思是立项依据里面仅仅有靶标分子与临床问题的关系，一个科学问题，一个明星通路这几个证据，是否足够支撑假说呢？期待您的解答探讨，谢谢！-由于问题具有一定代表性，又似乎难以三言两语说清楚，酸菜特地花点篇幅来解答，同时回馈给有同样适应症的小伙伴们。第一个问题 先解释在科学假设构思中如何具体选择通路和分子。科学假设中添加具体的机制是出于课题深度的需求，很多申请人到今天都不甚理解。国自然尤其是面上项目近几年竞争惨烈，优秀的申请人层出不穷，因此基金不会资助一些刚刚发现表型、现象，对于分子机制一无所知的项目，通常要求课题有预实验结果来指示下一步工作方向，否则上来就要做一些通路和相互作用分子的筛选和验证研究，可能存在不确定 的科学风险。换句话说，一向“锦上添花”的国自然项目在优中选优的形势下，自然淘汰了没有深度和前期基础的课题。那么，到底如何来设计机制更能说服评审呢？我觉得这个问题答案显而易见，机制并非申请人臆想出来的，而是基于前期扎实的实验结果，一般是采用筛选的策略，尝试“大海捞针”从大数据中窥知一二。不愿意拼工作量而愿意拼人品的讨巧策略也有，那便是根据文献的提示、自己的偏好“推测”，即挑一些已知的、明星的机制来套。经验老道的研究人员在猜机制的时候成功率一般还蛮高的，大概三五个假设下就可能验证成功一个，那么接下来就是如何补全数据，讲好故事的过程了。在没有任何前期实验的基础上，也不仔细分析分子背景、挖掘相关的文献报道，凭空选择一个明星通路的事情是匪夷所思的，但是在我们身边也不鲜见，这就是很多课题说服力很弱的原因，连自己提出假设的立论基础都没有，说服自己都显得牵强，如何躲过挑剔的基金评审专家的眼睛？往往在专家发现你抓的机制（通路、分子）既没有扎实的实验证据支持，又缺乏充分的文献证据，可行性较差的时候，项目的命运已经岌岌可危了。概言之，一切没有前期研究打基础的机制假设都是耍流氓，机制不是一场自导自演的戏，它是事实，就在那里，你需要找出来。当然一个分子可能有一百种作用方式，而你只需要走通一条路，能自圆其说即可，这才使得“去伪存真”似乎还有点可能性。第二个问题 为什么要挑一些热门的、明星的通路来阐释靶分子的机制，是否是思路闭塞，从而丧失一些重大科学发现的机会？参照前一个问题的回答，机制是做出来，不是猜出来的，所以无论是热门还是冷门，我们都是基于实验证据来演绎，不施加过多的主观因素。然而，这个问题还需要更深层次的讨论。我的反问是：“医生做科研是不是一定要发 C.N.S.？国自然申请人是不是一定要发过 10 分以上的权威期刊才能资助？”从实际资助的情况看，要求显然没有那么高。绝大多数受资助的国自然项目也没做出什么惊天动地的研究成果，无非是发一些五分以下，甚至三分以下的 SCI 就交差结题了。这种层次的文章基本不存在“既往未发现的全新通路或机制”，所以作为医生，有必要那么为难自己吗？我从不否认一旦你从科研中总结出套路，尝试用一些所谓的“术”来搞研究，也就告别了一个“科学家”的内核科学发现的本质是创新，不是重复。但是医生搞科研、拿国自然基金并不必讳言“功利主义”的心态，不少申请人明明基础薄弱，却还想投机取巧，幻想着中“大奖”。即使发了很多文章基础扎实的，想的也是完成晋升指标，并不是真要解决什么重大科学问题。这一点本质上也没有错，如果一定有错，错的也是制度。医生这样一个本身需要不断学习，经验至上的行业，沦为基础科研和论文基金的奴隶，这是我们的悲哀，而在困境中破壳而出的途径，必然优先选择省时、不费力的研究套路，而把冷门的，难验证的方案抛弃掉，这只能说是“物竞天择、适者生存”罢了。我也有些扯远了，回归标书的立项依据。拥有临床问题、科学问题、靶标分子、调控机制四个要素完全足够，因为在 3000-4000 字的篇幅中，仅综述你的临床问题、科学问题和靶标分子就要耗费 2500 字左右，没有详实的背景综述就难以体现你对课题的驾驭，接着在前期研究基础上提出一种新的机制来解释前期的问题，创新性也有保障。对于初学者而言，不要尝试一次谈两个科学假设（一大一小嵌套），或者提出不止一种分子机制（网络状的机制而不是线性的），这会让课题变得极其“烧脑”，一旦申请人论述的逻辑性没有掌握好，就会被其反噬，出现说服力不足。最后，请记住酸菜介绍的都是写基金的“套路”，并非唯一的路，高段位选手可以无视之，自由发挥，来去自如。然而初窥门径的小伙伴也不必太纠结，追求一鸣惊人，容易走火入魔。安心参照 Protocol 把任务流程走完，写出一份逻辑严密，论证充分，假设合理的标书，摆脱之前毫无头绪的“门外汉”状态，便是巨大进步了。我们的写作工具只是做了从 60 分到 80分的工作，如果以前不及格的，也能在最快速度内达到 80 分水平，Enjoy it！(有需要进一步了解了解酸菜独家原创的国自然写作工具的用户，请添加解螺旋微信助手（微信号：helixlife0）进一步咨询！)立项依立项依据的框架性思维据的框架性思维 在一个个静谧的夜晚辗转反侧，思虑着一个高大上的科学假设的小伙伴，你们这种“憋”的状态是对的，但酸菜马上就能掌握两条重要信息：1、兄弟你实在没啥前期工作基础，要不然怎么会对复杂的研究方向纠结不已呢；2、是不是有几年没正经看过文献了？科学界都在发生什么都不知道，抓科学问题肯定难。同时，对于这种基础水平的申请人，虽然是医生中的大多数，酸菜只能引用魔兽世界中的一句台词：愿圣光保佑你，我的孩子！潜台词你懂的，国自然资助率不到 20%，似乎不是为大多数人准备的。闲言少叙，无数相信自己“人品”超群的申请人还指望通过一份漂亮的标书逆袭成功呢，咱们今天就来谈一谈基金写作中个人认为最难的部分：立项依据。写立项依据必须要写综述这一点小伙伴们大抵是知道的，我会阐述得更具体些。建立起科学假设后，申请人需要依据科学假设总结三份小综述：1、关于你研究的临床问题。现状、依然存在的不足和解决的思路；2、关于你研究的科学问题既然临床还有问题需要解决，必然是向基础研究要答案。科学问题无需面面俱到，择一热点的细节方向即可；3、关于你研究的靶标分子。你选择的靶分子是用来解开科学问题的钥匙，换句话说靶分子的某种调节机制一定在你所研究的科学现象中具有重要的作用，这是课题立论的基础，所以靶分子的研究背景也需要综述。我知道小伙伴们都喜欢干货，还有更细化的要求：第一份临床问题的综述，600-800 字，5篇左右参考文献；第二份科学问题的综述，800-1000 字，15 篇左右参考文献；靶分子的综述一般也需要 800-1000 字，但如果靶分子非常新没有相关报道，可考虑综述类似功能的分子或者分子家族等，10-15 篇参考文献。对字数和参考文献有所规划是考虑到最终立项依据以 3000-3500 字，平均每百字一篇参考文献为宜。所谓磨刀不误砍柴工，事先将综述材料组织好，可以避免一边查文献一边写作标书的尴尬，保证思路的完整性。立项依据强调论证严密，突出内在逻辑十分重要。写作方面，在建立科学假设的基础上，按照由浅入深的推演顺序来展开是常规做法，一般采用线性结构：由此可见，立项依据说理过程的逻辑主线是：先回顾课题的研究背景，之后在理论（文献引用）和前期工作基础上，我们提出科学假设X 通过 Y 介导 Z 效应，而 XYZ 的调控模式是解答我们所研究临床科学问题的关键信息，对于明确X在某一生物学行为中的角色，提升其临床转化价值具有重要意义。当然，还有一些问题尚未阐明，这也就是我们在本项目中拟开展一系列研究工作。将上面的套路进一步形象化，图示如下：将上面的套路进一步形象化，图示如下：扎实的前期工作是国自然特别强调的一个要求，我们在三个方面予以阐述：扎实的前期工作是国自然特别强调的一个要求，我们在三个方面予以阐述：1、在提出临床问题或探讨科学问题的时候，可以穿插申请人的前期工作，由此体现出研究的延续性。如果申请人所在科室在学科上有传统优势，也应该结合研究背景说明；2、合理交代靶标分子的来源也涉及到描述申请人的工作基础，如果前期发表了论著，那是极好的；3、在靶标分子的作用机制方面，同样需要前期实验基础，为下一步研究工作指明方向。到了这一步，立项依据已经有了七八分模样，再注意几个小细节就更到了这一步，立项依据已经有了七八分模样，再注意几个小细节就更完美完美了了:逻辑上独立的部分取个副标题式，能够令立项依据看起来逻辑更清晰，尤其适合前期基础较薄弱申请人，因为没那么多内容可以承前启后；重点的语句加粗或者下划线，有利于评审人快速抓住重点，也方便之后总结标书的摘要；融入一些新颖的热点的科学问题到科学假设中，能够提升课题的创新性，给评审专家申请人科研素养良好的印象；引文尽量采用近 5 年的文献。国自然申请立项依据的三大忌国自然申请立项依据的三大忌 写立项依据要讲究化有形为无形。立项依据是基金申请书的重点。需要逻辑清晰，条理清楚，重点突出。立项依据也不宜过长或者过短，以描述清楚本申请课题的主要背景和意义、国际/国内学术界的研究进展、本研究组的相关前期工作、本研究方向存在的问题以及本申请课题要研究问题以及意义即可。立项依据有三个重要基础:一是要有与拟申请项目研究内容有关的预实验结果，二是要提供对拟研究内容的研究思路，三是有文献基础，但是往往有人把握不住重点，弄巧成拙，尤其是以下几点提醒给位注意，请尽量避免。一忌大话空话喊口号 长期以来，部分做科研的人开始使用新闻性的方法写立项依据。如：引经据典、使用热点词汇、大量使用形容词副词等修辞、做简单化解释等。同时大谈美好前景。这一特点甚至在很多论文中都能看到。其极端形式是：假大空。不要从“大处落墨”，不要用学科的意义来“装点”你问题的意义，也不要陈述一般性的常识，也不要写决心书，满纸“豪言壮语”，如“为科学创新做贡献”，“为科学决策提供理论基础”，等等，这些都是大话和空话！二忌文献罗列无主次 在立项依据里，最主要的内容是对研究现状的评述。千万不要把它写成研究者的姓名和标题的罗列，如 XXX 做了什么课题，YYY 做了什么实验，ZZZ 提出了什么方法如此罗列，给人的感觉是，你只把相关文献的检索结果摘抄下来了，谁知道读了没有，读得怎样。那样的句子，不读文献也能写出来。要将文献中的内容融会贯通有机地变成自己的依据，只须写与你的题目相关的东西，如提出什么方法或模型，能解决什么疑难。如果哪句话能随便放进别人甚至每个人的申请书里，那句话就该删除了。三忌逻辑混乱无主线 文献的评述，应该放在问题的逻辑框架下，而不能是随意的读书笔记。每篇文献、每句话都要切合你的问题，以问题所涉及的内容、方法、结果和遗憾等等，来组织不同的文献，让前人的研究成果自然融入你对问题的阐述中。千万不要跟着文献索引走或者跟任何一篇文献的思路走走自己的路，让文献退避到括号里面去吧！总之，写文献评述时，要换一种角色，即使自己是后辈或小卒，也要挺起身子来站在巨人的肩上，假装为一个大师去指点江山，让那些文章看起来只不过是为了你现在的研究而做的准备，而现在，你这位主角要出场了！最后，还要提醒一下，立项依据最好不要有过多的层次，如一、二、三、1,2,3,abc,1.1.2.a 等等。可以用几张彩色图来烘托气氛，增强功力。要特别重视对国内同行的相关工作的介绍，最好要有详实贴切的介绍。因为你的申请书有很大的可能落到他们的手中。一句“不了解同行的工作”就可能废了你的武功。创新点创新点评审专家挑刺的最爱评审专家挑刺的最爱 从科学假设衍生出研究内容和目标，接下来提炼的内容便是课题的特色与创新，逻辑思路可谓一脉相承。首先明确：特色与创新来源于科学假设的原创性。我们还是以前面说到的科学假设：在某临床问题所对应的科学问题中，靶标分子 X 通过介导 Y 通路（分子）产生 Z 效应为例来说明。先问自己，X 分子具有 Z 效应是不是申请人的发现，如果是则此为创新点 1；再问自己，X 分子介导 Y 通路发挥 Z 效应其中的机制是不是申请人原创，此为潜在创新点2；然后，结合科学问题，问一问 XYZ 调控通路是否在此问题中是一种新机理解释？如果是可作为创新点 3；最后，结合临床问题，探讨 X 是否具有临床转化价值？如果申请人首次提出其临床相关性可视为创新点 4。前面谈到研究内容不宜贪多，与此类似，青年基金一般有 2-3 项创新点足矣，而面上项目 3项创新点则恰到好处，所以上面总结的创新采纳 2-3 条即可，无需全部罗列。到了这个阶段，你会发现科学假设原创的重要性，如果申请人过多借鉴了文献中的思路，甚至照搬靶标分子和通路，就会发现无法总结出那么多条创新，临床、科学问题不新颖，靶标分子也有相关报道，这种情况下只能尝试从研究方法、模型、观察指标等细节入手寻找创新点。比如：申请人应用了比较新的基因操作方法，以此实现特异性地靶基因调控；申请人构建了原发性的疾病模型，相比于诱导性模型能够更好模拟人的疾病发展等等。然而，沦落到这一步，项目的前景已岌岌可危了 也许你有扎实的研究背景，确实能够说服评审即使是小小的突破也是多年积累后重要的收获，在这一领域内报道虽多，但申请人很早就参与其中，工作有延续性，并非一时兴起搞移植性研究，那么可能还有救。酸菜提供了一种前后逻辑一致的舒展套路，肯定不是唯一的写作方法，创新性的总结花样繁多，在此就不一一阐释了，如果上面的路子也对你胃口，相信总结创新点也只需要吃杯泡面的功夫。接下来别忘了拟解决关键科学问题与创新点相互呼应的关系，赶紧把这一部分也解决掉。X 分子是否具有影响 Z 的功能表型，观点原创则可作为第 1 个关键科学问题；X 分子发挥作用的通路和分子机制，观点原创则可作为第 2 个关键科学问题；XYZ 的信号轴是否是理解科学问题的一种新机理？作为第 3 个关键科学问题；X 是否具有临床上转化为分子标志物的意义？作为第 4 个关键科学问题。创新点有几条，就可以对应列出关键科学问题，拟解决关键科学问题必须描述解决方法，写作套路专刊第三期有探讨（回复关键字 218），依然是“应用研究方案中的精细设计获得实验证据，从而逐一解答了各个关键科学问题，达到了研究目的”。可以按照组织、细胞、动物、分子四个层次来梳理，几个不同的维度研究内容相互佐证推导出 X 是否有功能？X 的通路机制是什么？X 机制的解析对于整个项目的科学问题有什么帮助？这几个问题的结论。基金申请书研究方案的万宝全书基金申请书研究方案的万宝全书 谈及研究内容和研究目标的时候，我们已总结了课题的研究范畴，研究方案的小标题是完全可以据此归纳的，依然可以从临床、细胞、动物和分子四个层次进行设计，划分为 3-4 个部分。1 1探讨 X 的表达与临床因素及预后的相关性，明确临床意义 需要考虑收集什么样本，应用什么实验方法，检测什么指标，最后如何统计数据。尤其是外科医生，找上几百例标本，做做免疫组化的蛋白检测，然后多因素分析、生存分析，套路是比较熟悉的，我提供一篇例文，不赘述了。（回复“1219”下载文献）2 2阐明 X 的功能角色，理解 X 表达改变与疾病相关内在原因 功能表型的研究一般以细胞模型为平台，将细胞分为对照和病理模型两种，或者模型上增加干预因素（加药或分子操作），然后利用一些检测方法和数据指标来评估研究对象的变化。肿瘤研究之所以火热，很大程度上是因为大量稳定的细胞、动物模型以及观察指标的试剂盒，比如凋亡可以用 TUNNEL 和 AnnexinV 的试剂盒，转移可以用 Transwell 实验检测，一样有试剂盒，无需操心建立方法学的难题。根据 RobertA.Weinberg 在 2011 年那篇里程碑综述Hallmarksof Cancer:The Next Generation，肿瘤有以下典型的生物学行为：维持增殖信号；逃避生长抑制；侵袭与转移；无限复制能力；诱导血管新生；抵抗细胞死亡；免疫逃逸；能量代谢失调；基因组不稳定与突变；炎-癌转化，相应的常用检测方法列举如下：细胞增殖/存活：MTT、CCK8、Brdu 细胞迁移：划痕愈合、Transwell 小室 细胞周期：PI 染色流式检测 细胞凋亡：AnnexinV/PI 双染色流式实验、线粒体膜定位、DAPI 染色 血管新生：Transwell 血管形成、动物模型、血管形成标记检测 基因编辑：shRNA（基因敲减）、CRISPR/Cas9（基因敲减、敲除、突变）炎癌转化：炎症因子的表达检测、细胞形态观察 上述观察指标中，常用的动物模型有：移植性肿瘤模型（常用的裸鼠品系有 Balb/c、NOD/SCID 等）；自发性肿瘤模型（如 MMTV-PyMT 转基因小鼠：自发性乳腺癌肺转移动物模型）；诱发性肿瘤模型（如使用强化学致癌物二甲基苯蒽（DMBA）和甲基胆蒽可诱发乳癌，二苯苄芘可诱发纤维肉瘤）等。动物模型的建立和观察可以作为一节内容单独呈现，也可与细胞合并作为功能学研究一起放在实验方案中。3 3解析 X 发挥作用的分子机制，从而回答 X 如何调节功能的问题 分子机制是国自然研究内容的重头戏，自然也是研究方案中突破的关键，往往占到至少一半的工作量。医生们写到这一部分的时候经常感觉抓耳挠腮，无从下手。我觉得梳理分子机制的话可以再读一读解螺旋的一篇文章（中心法则虐我千万遍，直接回复数字 203），从中寻找灵感。说起来并不复杂，从 DNA 到 RNA，我们称之为转录，从 RNA 到蛋白，称之为翻译，经常被研究的机制模式主要有：X 影响 Y 从 DNA 到 RNA 的转录；X 影响 Y 的 RNA 转录后调控；X 影响 Y 从 RNA 到蛋白的翻译过程；X 影响 Y 翻译后的修饰。上述这些调控都能够最终导致 Y 蛋白（功能的执行单位）发生表达或活性的改变，最终影响功能。第一种模式中最令研究者痴迷的是一类叫转录因子的分子，因为能够调控多个基因的转录过程，被认为像开关一样的存在，如果你所研究的靶分子据报道有 DNA 结合的结构域和转录因子活性，那么你的分子机制研究方案无疑要围绕如何筛选和鉴定靶分子能够结合的 DNA序列以及调控的下游分子。第一种模式常见筛选和验证方法：敲减/过表达或者突变 x 后检测 Y 的 mRNA 水平（预实验）；用 Luciferase 实验验证 X 对 Y 的调控；ChIP 筛选/验证蛋白-DNA 的结合。第二种模式目前非常火热，因为发现了很多转录后调控的分子机制，比如 miRNA，ncRNA等等，而本身 RNA 成熟也需要在前体之上的加工和剪切。我想今年写 lncRNA 的小伙伴肯定不少，所以对于一个基因的 mRNA 因为与其他 RNA 分子结合导致翻译抑制的机制，你们应该有兴趣，我也推荐一篇文献，可参考其中的一些研究设计（回复“1219”下载文献）。别忘了，lncRNA 也可以直接调节转录或者翻译过程，按图索骥吧。第二种模式常见筛选和验证方法：敲减/过表达或者突变 x 后检测 Y 的蛋白水平（预实验）；用 Luciferase 实验验证 X 对 Y 的调控；用 X 的拮抗物（如 miRNA inhibitor）拮抗 x 后，检测 Y 的表达。第三种模式同第一种类似，这类分子称为翻译因子，研究的热度逊于转录因子，但因为近期也有翻译因子的分子靶向药物问世，也不失为一个值得关注的方向。翻译因子结合的序列是RNA，经常采用蛋白钓 RNA 的策略，或者反过来，方法学上也比较成熟。第三种模式常见筛选和验证方法：敲减/过表达或者突变 x 后检测 Y 的蛋白水平（预实验）；通过 RIP 的方法筛选/检测蛋白与 RNA 的结合。第四种模式最为人所熟知的是蛋白的磷酸化修饰，当然蛋白的修饰方式还有很多，影响其功能、定位、甚至是归宿。在蛋白水平研究机制在 RNA 调控大热之前一直是主流，即使现在也完全不会落伍。酸菜所在实验室就喜欢用蛋白-蛋白相互作用来研究机制，实验方法稳定可靠，有时候你做惯了一种套路，你总会难以割舍。第四种模式常见筛选和验证方法：敲减/过表达或者突变 x 后检测 Y 的磷酸化（也可以是乙酰化、糖基化等）（预实验）；酵母双杂或者 Co-IP、GST-pulldown 等实验验证蛋白-蛋白相互作用；细胞免疫荧光（或细胞组分分离分别检测蛋白表达）检测 XY 的共定位。于分子机制研究的奥妙真的可以说上一整天，但我想作为医生也不必学贯中西以致抢科学家们的饭碗。如果说分子机制研究模式还有什么重要信息要交代的话，我只想补充一点：上面谈到 X 影响 Y，有时候研究对象也可以聚焦到 Y：把 Y 作为靶分子，研究什么因素调控它，即上游的机制，与 X 作为靶分子，研究它调控什么，即下游的机制，其中便蕴藏的丰富的变化了。别晕，再复杂也就这点套路了。基金摘要的凝、集、推、解四段心法基金摘要的凝、集、推、解四段心法 之前酸菜就谈到，摘要那是要全文定稿之后再拟定的，因为正文的很多修改都或多或少会影响摘要的内容，为了避免重复劳动，故而由此安排。看看日子也快到交稿的截止日期了，是时候给小伙伴们抖一抖基金标书中摘要撰写的独家秘笈了那便是“凝、集、推、解”四段心法。欲练此功，无需自宫，找个心静的间歇，花上半个小时，泡一杯清茶相佐便可以了。如果说“文采”这东西对于写基金有什么帮助的话，到了总结摘要的阶段，其重要性就凸现出来了。摘要有 400 个字符的限制（即包含标点符号），如何在有限的篇幅内把故事讲清楚，十分考验一个人的逻辑思维和文字驾驭能力。字数少了，显得信息披露不充分，所以一般 380-400 之间是比较理想的呈现方式，斟字酌句进行内容取舍，同时还要保持语言的流畅性，达到行云流水，一气呵成的境界，还是颇有难度的。闲言少叙，咱们直接来看一个示例：【凝：大肠癌术后复发中肝转移是最常见的转移模式，其内在的机制尚不够清晰。集：申请人关注于肠癌肝转移的异位种植微环境调控，在前期发现激活肠癌细胞膜表面半乳糖残基，能够与肝细胞膜上特异性受体相互作用而使肠癌细胞定居于肝脏，相关成果已发表 SCI 论文。推：通过组织标本中筛选影响肠癌肝转移作用的长链非编码 RNA，我们聚焦于 LAO，在体外实验中该分子能够抑制细胞间粘附作用，促进运动迁移，并且调控细胞分泌免疫负调节因子，在局部形成利于转移灶形成的微环境。在大样本的组织标本检测和统计分析中，我们确认 LAO 与肝转移的发生及患者预后密切相关，具有临床转化价值。进一步研究还表明，LAO 能调节糖基转移酶，改造肠癌细胞产生适合于肝脏种植的膜表面生物标志。解：本项目拟在此基础上结合体内、体外模型，多角度验证 LAO 在大肠癌肝转移调控中的作用方式和调节糖基转移酶的分子机制，解析其发挥功能效应的途径及作用靶点，鉴定分子相互作用的精细模式。（399 字符）】凝，凝练临床问题。往往是 1 句话，说明申请人的课题是为了改善什么临床困境。如果你的问题较有新意，多费些笔墨亦可，可以加上 1 句关于临床意义的描述，但如果是常见问题，则力求简明扼要，不拖泥带水。集，聚焦科学领域。也是 1 句话就好，一个临床问题可能存在诸多的科学问题切入点，需要阐明申请人的兴趣所在（往往涉及到热点），给评审一目了然的印象。这时候要是申请人背景很强大的，不妨结合自己的前期研究工作来展开，表现出你在该领域的积累和水平，有高水平文章（IF5）的话，我会毫不吝啬把字符数留给报上权威期刊的名号，充分地表现加分项。推，既是推理演绎也是推陈出新。这是摘要的内容核心，需要 2-3 句话，重点说明申请人的前期研究发现以及相应的学术价值，总结支撑科学假设的实验证据，并有逻辑地推演整个研究 story。倘若篇幅允许，可以加 1 句话来解释本项目中有什么学术观点是新的，未见文献 报道。但关于前期研究结论千万不能缩水，我是宁可在前两部分精简文字也不会草率破坏“推”的完整性。解，解决方案。承接于“推”的故事，用 1-2 句话进行研究设计的补充完善，参考酸菜在研究内容部分介绍过的，从组织、细胞、动物、分子四个维度延伸不会犯错。总之是告诉评审大人通过本项目的执行，能够进一步解答一些科学问题，为临床困难的破局奠定“理论基础”。有时候字数有富裕，便会来 1 句务虚的“拔高”，效果其实不大，但撑满字数嘛，好歹也是个态度。解构到这里，小伙伴们可对国自然基金摘要的写法新技能 get了？“凝、集、推、解”四段心法可谓酸菜君国自然基金系列的收官之作，觉得有用就转发或者点个赞吧！祝各位 2015年都高中 NSFC 基金，我等你们的好消息。酸菜的国自然研究方案独家套路酸菜的国自然研究方案独家套路 上期我们说到了特色与创新与关键科学问题，今天接下去讲讲研究方案的套路。评审基金的关注点一直都是工作基础和思路，哪有空研究实验如何分组、检测什么指标和用什么仪器？所以这些都可以在前人的工作上进行“拿来主义”，当然，还是要稍作改动的。酸菜的研究方案依然可以从临床、细胞、动物和分子四个层次进行设计，划分为 3-4 个部分，可谓一招鲜吃遍天。探讨 X 的表达与临床因素及预后的相关性，明确临床意义 需要考虑收集什么样本，应用什么实验方法，检测什么指标，最后如何统计数据。尤其是外科医生，找上几百例标本，做做免疫组化的蛋白检测，然后多因素分析、生存分析，套路是比较熟悉的。阐明 X 的功能角色，理解 X 表达改变与疾病相关内在原因 功能表型的研究一般以细胞模型为平台，将细胞分为对照和病理模型两种，或者模型上增加干预因素（加药或分子操作），然后利用一些检测方法和数据指标来评估研究对象的变化。肿瘤研究之所以火热，很大程度上是因为大量稳定的细胞、动物模型以及观察指标的试剂盒，比如凋亡可以用 TUNNEL 和 AnnexinV 的试剂盒，转移可以用 Transwell 实验检测，一样有试剂盒，无需操心建立方法学的难题。根据RobertA.Weinberg在2011年那篇里程碑综述Hallmarksof Cancer:The Next Generation，肿瘤有以下典型的生物学行为：维持增殖信号；逃避生长抑制；侵袭与转移；无限复制能力；诱导血管新生；抵抗细胞死亡；免疫逃逸；能量代谢失调；基因组不稳定与突变；炎-癌转化，相应的常用检测方法列举如下：细胞增殖/存活：MTT、CCK8、Brdu 细胞迁移：划痕愈合、Transwell 小室 细胞周期：PI 染色流式检测 细胞凋亡：AnnexinV/PI 双染色流式实验、线粒体膜定位、DAPI 染色 血管新生：Transwell 血管形成、动物模型、血管形成标记检测 基因编辑：shRNA（基因敲减）、CRISPR/Cas9（基因敲减、敲除、突变）炎癌转化：炎症因子的表达检测、细胞形态观察 上述观察指标中，常用的动物模型有：移植性肿瘤模型（常用的裸鼠品系有 Balb/c、NOD/SCID 等）；自发性肿瘤模型（如 MMTV-PyMT 转基因小鼠：自发性乳腺癌肺转移动物模型）；诱发性肿瘤模型（如使用强化学致癌物二甲基苯蒽（DMBA）和甲基胆蒽可诱发乳癌，二苯苄芘可诱发纤维肉瘤）等。动物模型的建立和观察可以作为一节内容单独呈现，也可与细胞合并作为功能学研究一起放在实验方案中。解析 X 发挥作用的分子机制，从而回答 X 如何调节功能的问题 分子机制是国自然研究内容的重头戏，自然也是研究方案中突破的关键，往往占到至少一半的工作量。医生们写到这一部分的时候经常感觉抓耳挠腮，无从下手。我觉得梳理分子机制的话可以再读一读解螺旋的一篇文章（中心法则虐我千万遍），从中寻找灵感。说起来并不复杂，从 DNA 到 RNA，我们称之为转录，从 RNA 到蛋白，称之为翻译，经常被研究的机制模式主要有：X 影响 Y 从 DNA 到 RNA 的转录；X 影响 Y 的 RNA 转录后调控；X 影响 Y 从 RNA 到蛋白的翻译过程；X 影响 Y 翻译后的修饰。上述这些调控都能够最终导致 Y 蛋白（功能的执行单位）发生表达或活性的改变，最终影响功能。第一种模式中最令研究者痴迷的是一类叫转录因子的分子，因为能够调控多个基因的转录过程，被认为像开关一样的存在，如果你所研究的靶分子据报道有 DNA 结合的结构域和转录因子活性，那么你的分子机制研究方案无疑要围绕如何筛选和鉴定靶分子能够结合的 DNA序列以及调控的下游分子。第一种模式常见筛选和验证方法：敲减/过表达或者突变 x 后检测 Y 的 mRNA 水平（预实验）；用 Luciferase 实验验证 X 对 Y 的调控；ChIP 筛选/验证蛋白-DNA 的结合。第二种模式目前非常火热，因为发现了很多转录后调控的分子机制，比如 miRNA，ncRNA等等，而本身 RNA 成熟也需要在前体之上的加工和剪切。我想今年写 lncRNA 的小伙伴肯定不少，所以对于一个基因的 mRNA 因为与其他 RNA 分子结合导致翻译抑制的机制。别忘了，lncRNA 也可以直接调节转录或者翻译过程，按图索骥吧。第二种模式常见筛选和验证方法：敲减/过表达或者突变 x 后检测 Y 的蛋白水平（预实验）；用 Luciferase 实验验证 X 对 Y 的调控；用 X 的拮抗物（如 miRNA inhibitor）拮抗 x 后，检测 Y 的表达。第三种模式同第一种类似，这类分子称为翻译因子，研究的热度逊于转录因子，但因为近期也有翻译因子的分子靶向药物问世，也不失为一个值得关注的方向。翻译因子结合的序列是RNA，经常采用蛋白钓 RNA 的策略，或者反过来，方法学上也比较成熟。第三种模式常见筛选和验证方法：敲减/过表达或者突变 x 后检测 Y 的蛋白水平（预实验）；通过 RIP 的方法筛选/检测蛋白与 RNA 的结合。第四种模式最为人所熟知的是蛋白的磷酸化修饰，当然蛋白的修饰方式还有很多，影响其功能、定位、甚至是归宿。在蛋白水平研究机制在 RNA 调控大热之前一直是主流，即使现在也完全不会落伍。酸菜所在实验室就喜欢用蛋白-蛋白相互作用来研究机制，实验方法稳定可靠，有时候你做惯了一种套路，你总会难以割舍。第四种模式常见筛选和验证方法：敲减/过表达或者突变 x 后检测 Y 的磷酸化（也可以是乙酰化、糖基化等）（预实验）；酵母双杂或者 Co-IP、GST-pulldown 等实验验证蛋白-蛋白相互作用；细胞免疫荧光（或细胞组分分离分别检测蛋白表达）检测 XY 的共定位。关于分子机制研究的奥妙真的可以说上一整天，但我想作为医生也不必学贯中西以致抢科学家们的饭碗。如果说分子机制研究模式还有什么重要信息要交代的话，我只想补充一点：上面谈到 X 影响 Y，有时候研究对象也可以聚焦到 Y：把 Y 作为靶分子，研究什么因素调控它，即上游的机制，与 X 作为靶分子，研究它调控什么，即下游的机制，其中便蕴藏的丰富的变化了。别晕，再复杂也就这点套路了。国自然申请中的“科学问题”和“关键问国自然申请中的“科学问题”和“关键问题”题”先来说个故事：某校领导拿了几份当年没有获得批准的申请书去国家基金委相关处室“请教”这几项为什么没有批准，希望多了解一点