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敲减及过表达实验程序设计简图.pdfVIP免费

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构建表达目的基因质粒,根据靶点序列覆盖位置,选择构建表达质粒根据目的序列设计3-4靶位点按照设计靶点序列,构建3-4个病毒质粒293T工具细胞转染细胞表达目的基因选择部分基因序列的293T筛靶工具细胞分别导入工具细胞进行Westernblot筛靶,选取最有效的靶点序列获得有效靶点序列(质粒水平)目的序列病毒大包装在目的细胞中做Westerblot和Realtime内源验证靶点的有效性带感染细胞制作,混合克隆细胞构建目的基因全部序列到病毒载体把病毒质粒导入293T细胞中检测基因表达情况。这包括有荧光表达检测,Westernblot检测,确定基因确实表达病毒小包装进行qPCR滴度检测,确定目的基因能包装成功病毒大量包装利用QPCR检测大量包装最后滴度利用Westernblot检测基因表达情况带感染目的细胞,制备混合克隆细胞株

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