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临床医学检验技师考试辅导《临床免疫学和免疫检验》　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 第七章　放射免疫分析 　　第一节　放射免疫技术 　　第二节　放射免疫分析 　　第三节　免疫放射分析 　　第四节　放射免疫分析技术的应用 　　 第一节　放射免疫技术 　　放射免疫分析是利用放射性核素可探测的灵敏性、精确性和抗原抗体反应特异性相结合的一种免疫技术。 　　早期的放射免疫技术是基于竞争性结合反应原理的放射免疫分析（RIA），稍后又发展了非竞争性结合的免疫放射分析（IRMA）。 　　一、基本类型及原理 　　1.放射免疫分析（RIA） 　　是以放射性核素标记的抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体为基本原理来测定待检样品中抗原量的一种分析法。 　　2.免疫放射分析（IRMA） 　　是用放射性核素标记的过量抗体与待测抗原直接结合，采用固相免疫吸附载体分离结合与游离标记抗体的非竞争放射免疫分析法。 　　二、常用的放射性核素 　　放射免疫技术常用的放射性核素有125Ⅰ、131Ⅰ、3H、14C等。使用最广泛的是125Ⅰ。 　　三、标志物制备及鉴定 　　采用放射性碘（如125Ⅰ）制备标志物的基本原理是以放射性碘原子通过取代反应置换被标志物分子中酪氨酸或酪胺残基以及组胺残基上的氢原子。 　　（一）标记及类型 　　1.直接标记法 　　最常用于肽类、蛋白质和酶的碘化标记，其原理是采用化学或酶促氧化反应直接将125Ⅰ结合于被标志物分子中酪氨酸残基或组胺残基上。 　　其特点是标记方法操作简便，容易将较多的125Ⅰ结合到被标记蛋白分子上，易得到比放射性较高的标志物。常用的方法为：①氯胺T（ch-T）法；②乳过氧化物酶标记法。 　　2.间接标记法 　　也称连接标记法（Bolton-Hunter法），是最常用的间接碘标记方法。该法主要用于甾体类化合物、环核苷酸、前列腺素等缺乏碘标记基团的小分子化合物的标记。 　　纯化标志物的方法有利用分子筛机制的凝胶过滤法、利用游离125Ⅰ与标志物分子极性差异进行吸附解离的离子交换层析法、按分子所带电荷和直径不同在电场作用下分子迁移速率不同进行分离纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）以及高效液相色谱法。 　　（二）标志物的纯化 　　125Ⅰ标志物反应后，标志物需进行分离纯化以去除游离125Ⅰ和其他杂质。纯化标志物的方法有利用分子筛机制的凝胶过滤法、利用游离125Ⅰ与标志物分子极性差异进行吸附解离的离子交换层析法、按分子所带电荷和直径不同在电场作用下分子迁移速率不同进行分离纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）以及高效液相色谱法。 　　（三）标志物的鉴定 　　1.放射化学纯度 　　是指单位标志物中结合于被标志物上的放射性占总放射性的百分率，一般要求大于95%。 　　2.免疫活性 　　指制备的标志物与抗体结合的能力。 　　3.比放射性 　　指单位化学量标志物中所含的放射性强度，也可理解为每分子被标志物平均所结合放射性原子数目，常用Ci/g、mCi/mg或Ci/mmol等单位表示。比放射性计算方法有计算法和自身置换法。 　　四、抗血清鉴定 　　抗血清的质量直接影响分析方法的特异性和灵敏度。用于鉴定抗血清质量的参数主要有以下几项： 　　1.亲和性 　　是指抗体分子上一个抗原结合部位与相应的抗原决定簇之间的结合强度，常用亲和常数Ka表示。 　　2.特异性 　　是指一种抗体识别相应抗原决定簇的能力。 　　3.效价 　　是反映抗血清中有效抗体含量的相对参数，即抗血清稀释至能与抗原发生有效反应的最大稀释度。 　　五、方法学评价 　　为增强结果的可比性，需对RIA方法学进行评价。除常规的灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性等指标外，还应注意以下指标： 　　1、可靠性 　　2、剂量-反应曲线 　　3、高剂量钩状效应 　　 第二节　放射免疫分析 　　放射免疫分析（RlA）是以放射性核素作示踪剂的标记免疫分析方法，它具有高度灵敏性、特异性和精确性等特点，特别适用于激素、多肽等含量微少物质的超微量分析。 　　一、基本原理 　　经典RIA是采用标记抗原和非标记抗原竞争性结合有限量特异性抗体的反应。 　　二、实验方法及测定 　　RIA具体测定方法包括以下三个主要步骤： 　　（一）抗原抗体反应 　　根据RIA原理，将未标记抗原（标准品和待测样品）、标记抗原和特异性抗体加入反应试管中，在一定条件（温度、时间及介质pH）下进行竞争抑制反应。 　　（二）分离结合与游离标志物 　　RIA反应平衡后，标记抗原与试剂抗体形成免疫复合物（B）。由于其含量极少，不能自行沉淀，因此需加入适当的沉淀剂才能将其彻底沉淀，然后经离心使其与游离的标记抗原（F）分离。某些小分子抗原也可采用吸附法分离B与F。 　　目前RIA常用的分离方法有以下几种： 　　1.第二抗体沉淀法 　　2.聚乙二醇（PEG）沉淀法 　　3.PR试剂法 　　4.活性炭吸附法 　　（三）放射性测量及数据处理 　　分离B、F后，即可对标记抗原抗体复合物（B）进行放射性测量，也可根据RIA实验方法及目的，测定游离标记抗原（F）。绘制标准曲线（剂量-反应曲线），样品管以其测量或计算的反应参数，通过标准曲线即可查出相应的待检抗原浓度，目前已普遍采用计算机进行数据处理、自动绘制标准曲线和打印样品抗原浓度。 　　 第三节　免疫放射分析 　　免疫放射分析（IRMA）是在RIA的基础上发展起来的放射性核素标记免疫分析。 　　与经典RIA不同，IRMA是以过量125I标记抗体与待测抗原进行非竞争性免疫结合反应，用固相免疫吸附剂对B或F进行分离，其灵敏度和可测范围均优于RIA，操作程序较RIA简单。 　　一、基本原理 　　1.单位点IRMA 　　是先利用过量标记抗体与待测抗原进行反应，形成抗原-抗体复合物，反应平衡后,再用固相抗原结合反应液中剩余的未结合标记抗体并将其分离，测定上清液的放射量。 　　2.双位点IRMA 　　是先用固相抗体与抗原反应结合，然后再用过量的标记抗体与已结合于固相的抗原的另一抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物，洗弃反应液中剩余的标记抗体，测定固相上的放射性。 　　二、IRMA与RIA的比较 　　1.标志物 　　RIA是以放射性核素标记抗原，抗原有不同种类,标记时需根据其理化和生物学特性，选用不同的放射性核素和方法。IRMA则是标记抗体，为大分子蛋白，性质较稳定，不同抗体标记方法基本相同，标记抗体的比活度高，提高了测定的灵敏度。 　　2.反应速率 　　反应速率与反应物浓度成正比，IRMA反应中，标记抗体为过量，且抗原抗体结合为非竞争性，故反应速率比RIA快。 　　3.反应原理 　　RIA为竞争抑制性结合，反应参数与待检抗原量成反比。IRMA为非竞争性结合，反应参数与待检抗原浓度呈正相关。 　　4.特异性 　　IRMA采用针对不同抗原决定簇的双抗体结合抗原，反应受交叉反应物的干扰，较仅用单一抗体的RIA者小，测定特异性较高。 　　5.灵敏度和检测范围 　　IRMA反应中，抗原与抗体属非竞争性，微量抗原能与抗体充分结合；RIA中标记抗原和待检抗原竞争,与有限量抗体的结合不充分，故IRMA测定的灵敏度明显高于RIA。由于抗体量大，能结合较多的抗原量，IRMA用于抗原含量较高标本测定时，结果也较RIA好,IRMA标准曲线工作范围较RIA宽1～2个数量级。 　　6.其他 　　RIA所用抗体为多克隆性，因此对其亲和力及特异性要求较高，但用量很少；IRMA为试剂过量的非竞争性结合反应对抗体亲和力的要求不及RIA，但用量大。RIA可以测定大分子和小分子抗原，但IRMA则只能测定至少有两个抗原决定簇的抗原。 　　 第四节　放射免疫分析技术的应用 　　放射免疫分析技术自创立以来，由于其测定的灵敏度高、特异性强、精密度好，并可以对抗原和半抗原进行测定，且对仪器设备条件要求不高，因此广泛用于生物医学检验。常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的测定。由于大多数检验项目均有RIA或IRMA试剂盒提供，目前仍是基层单位对超微量物质测定的主要手段。但由于放射污染和危害，常用放射性核素半衰期短，试剂盒有效期不长，无法自动化分析等诸多不足，特别是近年来其他非放射性标记免疫测定技术及其自动化分析的飞速发展和普及，RIA将会逐渐被这些优秀的标记免疫分析方法所取代。 　　　　　　 第4页