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生物化学,第十五章 基因工程基本原理,华东理工大学生物化学精品课程组,华东理工大学精品课程系列,第十五章 基因工程基本原理,一、基因工程的定义及主要内容二、重组DNA分子引入宿主细胞和筛选鉴定三、克隆基因的表达四、基因工程的成就和展望,一、基因工程定义及主要内容,基因工程也称基因重组技术、基因克隆或分子克隆是指利用DNA重组技术生产或改造生物产品、创建或改良动植物品种以及开发特殊用途的微生物等是生物工程的重要内容之一,返回,主要步骤：1、构建DNA重组分子2、重组DNA分子引入宿主细胞和筛选鉴定3、基因的表达,一、基因工程定义及主要内容,返回,返回,基因工程基本程序,真核染色体DNA,克隆载体（质粒）,限制酶切割,限制酶切割并分离所需片断,重组载体,细菌宿主细胞的转化,细胞分离,培养增值,构建DNA重组分子,工具酶目的基因的制备克隆载体DNA分子的体外重组,返回,工具酶,限制性内切酶是基因工程中最主要的工具酶DNA连接酶（DNA ligase）、DNA聚合酶（DNA polymerase）、末端转移酶（terminal transferase）、逆转录酶（reverse transcriptase）、核酸酶S1（nuclease S1）和核酸外切酶（exonuclease）,返回,限制性核酸内切酶,能识别DNA特定核苷酸序列的核酸内切酶,分布：主要在微生物中。特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点。结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。举例：大肠杆菌的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。,限制性核酸内切酶,由Smith在1970年从流感噬血菌中发现细菌体内有特异的限制修饰系统，这种修饰系统是通过特殊的修饰酶在细菌本身DNA的特异识别序列处进行甲基化修饰，从而与外源DNA相区别。这样，限制性核酸内切酶就能去切割破坏外源DNA，而对本身无影响。目前已从原核生物中分离出400500多种限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶,限制性内切酶可识别4或6个特异核苷酸序列粘性末端：指限制性内切酶的切割部位不在识别序列的中心轴，在断段产生一个短的单股突伸出来的不齐末端。钝性末端：指限制性内切酶的切割部位在识别序列的中心轴处，即产生平齐末端。,返回,几种限制性内切酶的作用位点,返回,几种限制性内切酶的作用位点,返回,目的基因的制备,目的基因就是所需要克隆的外源基因制备方法：1、人工合成法2、逆转录法3、用限制性内切酶直接从染色体DNA中分离4、用PCR法扩增目的基因片段,返回,目的基因的制备：人工合成法,较小分子基因可用人工化学合成的方法获得DNA化学人工合成的方法已经自动化人工合成目的基因的先决条件是基因的核苷酸序列是已知的缺点是：1、不能合成太大的基因；2、合成基因时遗传密码的兼并现象会为选择密码带来很大困难；3、费用较高,返回,目的基因的制备：逆转录法,若所需基因较大，人工合成有困难，从组织中分离提取也不容易，则可利用逆转录法合成。该法是：以编码某特异多肽的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下反转录成该多肽mRNA的互补DNA（cDNA）；再以cDNA为模板，在逆转录酶或DNA聚合酶I（或其KIenow片段）作用下，最终合成编码该多肽的双链DNA（dsDNA）。可用于真核生物目的基因的获得,返回,目的基因的制备：逆转录法,返回,返回,目的基因的制备：逆转录法,用逆转录法合成cDNA的主要问题是：1、mRNA必需提得很纯2、逆转录中常产生各种不完全的逆转录产物，3、以单链cDNA为模板往往难以合成与单链cDNA一样长的dscDNA，这与实验技术有关。,返回,用限制酶切法直接从染色体DNA中分离,此方法主要适用于制备原核基因对于物理图谱已清楚的原核基因，可用限制酶把目的基因切出来鸟枪法是指把目的基因从已用限制酶降解的染色体片段群中分离纯化出的方法，即把包括目的基因在内的全部DNA片段插入到载体DNA（如pBR322）中，转化大肠杆菌，做成基因文库。再用目的基因的转录产物作探针，通过分子杂交，选择出含有所需基因的DNA片段。,用限制酶切法直接从染色体DNA中分离,此方法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因一样，也具有间隔顺序。此方法的缺点是：由于含有插入顺序，原始转录本不能被原核细胞识别，并将插入顺序切除，以形成成熟转录本，因此也得不到目的基因的产物多肽或蛋白质。,返回,用PCR方法扩增目的基因片段,PCR是聚合酶链反应的缩写是一种在体外模拟天然DNA复制过程的核酸扩增技术在有少量DNA模板、引物、四种dNTP、TaqDNA聚合酶、合适的缓冲系统下，通过仪器控制DNA变性、退火及延伸的温度与时间，来合成新的DNA链，新合成的DNA链又可作为下一轮循环的模板。理论上经n次循环后，DNA链可达2n,返回,用PCR方法扩增目的基因片段,返回,克隆载体,目的基因若无合适的载体协助，就很难进入受体细胞；为了保证目的基因能够繁殖，必需将它与载体连接理想的载体1、较小的、能进行复制的分子，具有高拷贝数2、具有较少的限制酶的切点，最好是单一切割点，以便所要克隆的DNA片段能被插入载体,克隆载体,3、外源DNA片段插入载体后，不得使载体的复制功能丧失4、具有某种明显的标志，例如抗药性标记，以便利用这些标志筛选阳性克隆5、携带外源DNA的幅度较宽6、生物防护是安全的,克隆载体,克隆载体,常用的克隆载体有：质粒、噬菌体及病毒质粒是某些细菌中独立于染色体外的共价闭合环状双链DNA。质粒具有复制能力，它的存在与否一般对细菌的生存没有决定性影响。噬菌体是一种能感染大肠杆菌的病毒，其DNA中的1/3对噬菌体的生长并非绝对需要，因此可被外源性DNA所替代，同时它可在体外包装成病毒颗粒，高效感染大肠杆菌。克隆容量小于23kb,克隆载体,粘性质粒（Cosmid），是人工构建的、兼具质粒与噬菌体双重特性的大容量载体。克隆容量可达45kb。酵母人工染色体：20世纪80年代发展起来的大片段外源基因克隆体系，其克隆容量可达2001000kb。,返回,DNA分子的体外重组,所谓重组DNA分子就是把外源DNA分子（目的基因）插入到载体中，使两种DNA分子连接起来体外DNA分子重组有两种方法：1、粘性末端连接法2、平头末端连接法,返回,粘性末端连接法,用同一种或两种限制酶去消化载体和外源DNA分子，可产生相同的粘性末端，这些粘性末端能退火互补，进一步用DNA连接酶将断端封口，即可获得重组DNA分子。用同一种限制酶处理外源DNA和载体，重组时可导致外源DNA特别是质粒的自我环化用碱性磷酸脂酶（不处理外源DNA分子）处理粘性末端的5磷酸基，能促使载体与外源DNA分子连接。重组体每条链仍残留的一个缺口，待进入宿主细胞内可被修复,返回,磷酸脂酶能防止载体的自我环化,返回,用两种限制酶处理载体也可防止环化,钝性末端连接法,用前述的化学合成法、逆转录法获得的DNA或cDNA片断，以及某些限制酶切生成的DNA片断，均为钝性末端，可用T4DNA连接酶连接，也可将其改造成粘性末端再行连接：1、加接头：这种人工接头含某种限制酶的单切点，用限制酶消化该接头可产生粘性末端。2、加尾巴：应用末端转移酶在载体与外源DNA分子上加上互补的同聚核苷酸，经过退火可使两者形成重组体,返回,钝性末端连接法,返回,末端转移酶处理,退火,二、重组DNA引入宿主细胞和筛选鉴定,重组DNA引入宿主细胞1、转染：将噬菌体DNA引入宿主细胞的过程2、转化：将质粒或染色体DNA引入宿主细胞的过程重组体克隆的筛选与鉴定1、插入灭活法2、噬菌斑形成筛选法3、核酸杂交法,返回,插入灭活法,目前使用的质粒载体都有抗药标记。被转化的细菌在含有这种（些）抗生素的培养基中能够生长，而未被转化的细菌则不能生长或被杀死。然而，当限制酶作用于载体DNA的某一抗药基因上并在此插入外源DNA时，载体上原有的抗药基因即被破坏。由此重组体转化的宿主细胞，则对这个抗生素敏感，这样便可筛选出转化菌株。,返回,返回,插入灭活法,限制酶切,转化,含四环素,T,AT,三、克隆基因的表达,外源基因在大肠杆菌体系中的表达外源基因在真核细胞体系中的表达,返回,四、基因工程的成就与展望,在农业上的成就与意义在工业方面的成就与意义在制药工业中的成就与意义癌症的研究与治疗遗传病的预防与治疗,插入灭活法,目前使用的质粒载体都有抗药标记。被转化的细菌在含有这种（些）抗生素的培养基中能够生长，而未被转化的细菌则不能生长或被杀死。然而，当限制酶作用于载体DNA的某一抗药基因上并在此插入外源DNA时，载体上原有的抗药基因即被破坏。由此重组体转化的宿主细胞，则对这个抗生素敏感，这样便可筛选出转化菌株。,返回,