ru-第2章 细胞生物学研究方法 20170925(1)(1).ppt

1,CHAPTER 2,细胞生物学研究方法 Experimental Approaches for Studying Cells,2,OUTLINE,2.1显微成像技术（TECHNIQUES OF MICROSCOPY）2.2 细胞组分的分析方法（TECHNIQUES OF CYTOCHEMISTRY、CELL SORTING、ISOLATION OF CELL COMPONENT）2.3 细胞工程技术（CELL ENGINEERING）2.4 组学研究技术(GENOME、TRANSCRIPTOMICS、PROTEOME),3,2.1 TECHNIQUES OF MICROSCOPY,镜像形成的三要素:照明系统(illumination)样品(sample)透镜系统(optics),物镜:玻璃 vs 电磁透镜目镜：玻璃 vs 荧光屏,可见光 vs 电子束 Light Electron,光学显微镜 电子显微镜(The Light Microscope)(Electron microscope),4,2.1.1 光学显微镜（The Light Microscope）2.1.1.1技术参数：放大率(magnification,M)M=物镜放大率 X 目镜放大率分辨率（resolution,R）:分辨出相邻两个物点间的最小距离R=0.61/NA（:波长，可见光0.40.7m）显微镜的数值孔径(numerical aperture,NA)NA=n sina（n，介质折射率;a，镜口角）,?最大分辨率a:70n:1.5(油):450nm(可见光)200nm(紫外光),5,2.1.1.2 常用光学显微镜：普通双筒显微镜(binoular microscope)相差显微镜:(phase contrast microscope)微分干涉显微镜(differential interference microscope）暗视野显微镜(dark field microscope)荧光显微镜(fluorescence microscope)激光共聚焦显微镜(laserconfocalscaning microscope),6,倒置显微镜,正置显微镜,7,相差显微镜：(phase contrast microscope)无色、透明、活细胞结构环形光阑（annular diaphragm）相位板（annular phaseplate）标本密度不同导致光程差 振幅差,8,DIC,微分干涉显微镜：(differential interference microscope）更强立体感，便于显微操作,9,暗视野显微镜(dark field microscope)：物体轮廓，无微细结构 丁达尔现象：光斜射到样品上,10,荧光显微镜：(fluorescence microscope)紫外光源激发细胞内荧光标记染料Excitation Emission,11,激光共聚焦显微镜：(laserconfocalscaning microscope)激光扫描、分辨力提高、可立体三维重建,12,2.1.2 电子显微镜(Electron microscope)电子束波长比光短100000倍亚显微结构（超微结构）：R 1nm,基本结构电子光学系统由照明系统、标本室、成像系统、观察窗和记录用的照相机等组成；真空系统是保持电镜的真空度；电子学系统即供电系统，需要高压稳压。,13,电子显微镜种类：透射电子显微镜：细胞内部结构观察(transmission electron microscope)扫描电子显微镜：样品表面形貌特征观察(scanning electron microscope)扫描隧道显微镜(scanning tunneling microscope)微观世界物质表面特征，但样品必须是导体原子力显微镜(atomic force microscope）微观世界物质表面特征，不要求导体，提供三维表面图，不需样品处理、常压及液体环境中工作；但分辨率低于扫描电镜,14,2.2 细胞组分的分析方法2.2.1 细胞化学技术（cytochemistry）2.2.2 细胞分选(cell sorting)2.2.3 细胞组分的分离(isolation of cell component),15,酶细胞化学技术（酶与底物）酶细胞化学技术就是通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞内的定位。免疫细胞化学技术（抗原抗体）利用免疫反应定位组织或细胞中的抗原成分分布 免疫荧光技术 免疫电镜技术放射自显影技术(radioautography)：利用放射性同位素标记研究细胞内大分子的合成动态（分布、定位、排出、合成等）其他：DNA、RNA染色:原位杂交技术(in situ hybridization),2.2.1 细胞化学技术（cytochemistry）Cell morphology+cell component analysis,16,2.2.2 细胞分选(cell sorting)流式细胞术(Flow cytometry)干涉检测器：发现细胞荧光检测器：发现标记染色体分选(chromosome sorting),17,2.2.2 细胞分选(cell sorting)流式细胞术(Flow cytometry),18,2.2.3 细胞组分的分离(isolation of cell components),超速离心技术(Ultra centrifugation)：分离细胞器与生物大分子及复合物 速度离心：差速离心、移动区带离心等密度离心：density gradient层析分离技术(High performance liquid chromatography,HPLC)：分离蛋白质 凝胶过滤(gel filtration)：亲和层析(affinity purification)：离子交换层析(ion-exchange chromatography),19,20,2.3 细胞工程技术（CELL ENGINEERING）,2.3.1 细胞培养(Cell culture)体外细胞培养的条件营养 环境因素 无菌环境、合适的温度、一定的渗透 压和气体环境、O2和CO2。后者对于维 持细胞培养液的酸碱度十分重要。代谢物和废物排除,原代细胞(primary cells)：从机体分离取出，10 passages细胞系(cell line)：原代培养物首次传代成功后细胞株(cell clone)：单细胞克隆,CHO细胞的培养,22,胚胎干细胞（embryonic stem cell）,体细胞（somatic cell）和 干细胞(stem cell),Yamanaka/Jaenisch四因子实验,Oct4Sox2MycKlf4,囊胚,显微注射,嵌合体小鼠,带选择标记的成纤维细胞,iPS细胞,移植,诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC）,24,基因敲除示意图（1）,25,基因敲除示意图（2）,26,2.3.2 细胞融合与单克隆抗体,27,2.3.3 基因转染与敲除转染(transfection)：将具有生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能敲除(knockout）:显微操作术(micro injection)动物细胞核移植克隆(Nuclear transfer)转基因鼠及选择性基因剔除(transgenic mice and conditional knockout),28,细胞核移植克隆,29,Knockout Mice,The technique used to generate knockout mice was developed in the late 1980s by Marlo Capecchi at the University of Utah.实验分三步 构建重组载体；转基因敲除；筛选。,30,基因敲除原理,31,2.4 组学研究技术(GENOME、TRANSCRIPTOMICS、PROTEOME)GENOME：High throughput DNA sequencingTRANSCRIPTOMICS:Gene expression array/ChipPROTEOME:protein array/Chip,tissue or cell chip,Mass spectrometry,思考题：1、普通光学显微镜、暗视野显微镜和相差显微镜各有什么特点，适于观察什么类型的样品？2、电子显微镜技术有哪些发展？与光学显微镜技术比较有哪些优缺点？3、细胞组分的分析包括那些基本的实验技术？,32,