植物组织培养(8)(1).ppt

9 植物细胞培养,植物细胞培养是指将植物单细胞或细胞团进行培养，形成单细胞无性系或再生植株的技术。,9.1 单细胞培养,植物单细胞培养是指将植物单细胞进行培养，形成单细胞无性系或再生植株的技术。,9.1.1 单细胞的分离,机械分离：研磨、过滤、离心酶解分离：利用果胶酶分解细胞间的胞间层，使其分散。由愈伤组织分离：液体培养、振荡、过滤、离心,9.1.2 单细胞培养方法,平板培养法看护培养法微室培养法纸桥培养法,细胞平板培养,平板培养（plating culture)是指将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中培养的技术。单细胞分离：一般采用酶分离法，小细胞团不能超过6个细胞，要选择合适的过滤网筛。单细胞悬浮液的制备：1105/ml植板：将1份已调整好密度的单细胞悬液与4份35的固体培养基充分混合均匀，然后均匀的平铺与培养皿中，厚度1mm左右。,看护培养,看护培养（nurse culture）Muir 等1954年设计。,Vessel for nurse cultures看护培养,双层滤纸培养,微室培养,Filter paper bridges 纸桥培养,9.2 悬浮培养,悬浮培养是将游离细胞或细胞团按一定密度，悬浮在液体培养基中不断地搅拌或振荡进行培养的技术。可以使培养细胞快速大量增殖。,双子叶植物比单子叶植物更容易建立悬浮培养。大多数建立悬浮培养的方法要求首先在离体条件下获得愈伤组织。,Callus induction,Suspension initiation,悬浮培养很少只由单细胞组成。大多数除了单独游离的细胞外，都有细胞团。建立了悬浮培养后，需要结合过滤，进行反复继代培养，以降低细胞团的大小。细胞团中的细胞与单独游离的细胞其微环境是不同的。,A typical aggregate of small,viable,isodiametric cells of a shoot cell suspension culture of Erythrina which occurs in the the exponentialand linear growth phases,A filamentous cell of a shoot cell suspension of Erythrina,A filamentous septated cell of a shoot cell suspension of Erythrina dividing actively at one end to form an aggregate,A giant filamentous cell(G)in a shoot cell suspension of Erythrina.Note the differnce in the size between the giant cell,the smaller generally occurring filamentious cells and the isodiametric cell.,A giant(G)and normal(N)isodiametric cell in a shoot cell suspension culture of Erythrina.,9.2.1 培养方法,分批培养半连续培养连续培养,1.分批培养,分批培养是指将一定量的细胞或细胞团分散在一定量的液体培养基中进行培养。特点：只有气体内外有交换。必须及时继代培养，约稀释5倍。,悬浮细胞生长S形曲线：滞后期、对数期、直线期、减缓期、静止期。,注意事项：,接种密度不能太低。及时继代（刚进入静止期时）。充分分散。振荡。,优点,设备简单：普通摇床操作简便重复性好,缺点：培养基成分不断改变，细胞数目、代谢产物和酶的浓度都不能保持恒定，不适合研究细胞的生长代谢。,2.半连续培养,在半连续培养中，当细胞增殖到一定量后，倒出一半细胞悬浮液于另一个培养罐内，再分别加入新鲜培养基继续进行培养，如此这样反复地进行再培养。优点：能够重复获得大量均一的培养细胞。应用：生化研究；为进一步的更大规模的培养提供接种材料。,3.连续培养,连续培养是利用特制的培养容器进行大规模细胞培养的技术。特点：体积恒定，营养物质不断得到补充，细胞可长期保持在对数生长期，增殖速度快，适于大规模工厂化生产。,类型,封闭型：培养基更换，细胞不排出。细胞数目不断增长。开放型：培养基更换，细胞也排出。细胞保持高生长速度。分恒化式（控制某种营养成分的浓度）和恒浊式（控制细胞密度）。,Bioreactor for continuous cell suspensions连续培养装置,Controlled chamber,9.2.2 培养基,用来建立生长快、易散碎的愈伤组织的培养基，也适用于悬浮培养，只是不加琼脂。无机磷消耗很快，是限制因子。初始密度较高：B5和ER。初始密度较低：条件培养基如KM8P。,9.2.3 振荡,目的：破碎细胞团，使细胞均匀分布，促进空气交换。方法：摇床（水平往复式、旋转式），搅拌器。,Shaker for suspension culture,Different types of shakers to ensure cell agitation,Glassware for the shaker,Glassware for the shaker,glassware for the shaker,Culture wheel,Vessels for use on the wheel,9.2.4 悬浮培养细胞的同步化,细胞同步化：指同一悬浮细胞培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。植物细胞培养中完全同步化十分困难：植物细胞在悬浮培养中游离性较差，容易团聚，并进入不同程度的分化状态。可以通过一定的理化措施使同一体系中的细胞相对处于同步化状态。,物理方法：控制细胞物理特性（细胞或细胞团大小）或生长环境（光照、温度等），如低温休克法。化学方法：饥饿法或抑制法。,一般，当细胞处于氮饥饿时，可获得G1期同步化细胞，当细胞处于磷和碳饥饿时，可获得G2期同步化细胞。,9.2.5 细胞增殖的测定,细胞计数细胞鲜重细胞干重细胞密实体积（PCV）或沉淀体积（SCV）,Haemocytometer for cellnumber counting,Filter apparatus to filter off cells to measure wet/dry weight,Centrifuge to spin down cells to determinepacked cell volume,Side arm flask to measure settled cell volume(note red callus in side arm),9.2.6 悬浮培养细胞的植株再生,直接形成体细胞胚。转移到固体培养基上形成愈伤组织再形成体细胞胚。,Somatic embryos,9.3 植物细胞培养的用途,次生代谢物,初级代谢产物是维持植物生存基本过程所必需的化合物，如碳水化合物、蛋白质和脂类。次级代谢产物是植物基本功能不必需的化合物。一些次级代谢产物可作为抵御细菌和病毒的化学防卫物。次级代谢产物在制药、香料、染料等工业上均有应用。次级代谢产物包括萜类、强心苷、固醇类化合物、生物碱以及其他一些化合物。,阿魏酸,莨菪碱 7-羟基-6-甲氧基香豆素,吗啡,药用化合物的生产,西方国家25%的处方药来源于植物。药用植物如按传统生长，费用昂贵，而在可控制的条件下进行细胞培养获得药品是理想的办法。不幸的是，除了少数几个例子外，在细胞培养中常常不产生次生代谢产物，或产生的量不足以供商业生产。细胞或器官培养生产的药用化合物有：薯蓣皂苷、可待因、吗啡、阿托品、天仙子胺、东莨菪碱、地高辛、洋地黄毒碱、奎宁、利血平、青蒿素、紫杉醇等。,成功的例子,细胞培养的一个应用例子是紫杉醇。紫杉醇用来治疗卵巢癌和乳腺癌，是从红豆杉的树皮和根皮中提取到的。,紫杉醇,紫杉醇很难合成，因为它有十个手性碳原子，理论上有1024种不同的立体结构。,立体结构（立体化学）,当碳原子周围有四个原子时，原子排布有两种方式。这两种方式互为镜像。通常只有一种镜像立体异构才具有生物学活性。天然情况下，酶反应结果只产生一种立体异构体，而在进行化学反应时两种构象都可以形成。,天然的红豆杉不能生产足够的药物，所以必须寻找替代的药物来源。下表给出了树、细胞和真菌（一种在该树上生活的真菌，也能生产紫杉醇）培养的生产效率。从表中可以看出，细胞培养比另外两种的产率都要高，是一种可行的生产路线。,分化,在许多愈伤组织培养或悬浮培养体系中，发现培养的细胞不像其母株那样生产次生代谢产物。然而，当发生分化时，无论是芽或根器官的形成，还是体细胞胚发生，分化的组织就开始生产与母株相同的次生代谢产物。,Thapsia garganica:Thapsigargins,calicum-ATPase inhibitors,are produced in the intact plant,but not in callus culture.Roots,shoots and somatic embryos regenerated from the callus produce thapsigargins.,细胞培养中不能生产次生代谢产物的原因可能是：将过程转到基本新陈代谢。抑制或减少了关键酶的表达。缺少合适的存储位置，如分泌细胞、分泌腔和液囊等，乳胶组织和腺毛只有在分化的组织中才具有。,色素生产,某些细胞培养积累高水平的色素。一个例子是紫草的培养，产生色素紫草宁（紫草素），用于化妆品。一些细胞培养可以生产花青素，红或蓝类黄酮，可以作为食品的天然色素。,Callus cultures of Oxalis reclinata酢浆草are yellow in the light,but when they are transferred to the dark,they start producing red anthocyanin pigments,诱导,当植物被微生物感染后，植物体内就积累了某些次生代谢产物植物抗毒素。这些化合物具有抗微生物活性，可作为保护植物的化学防护剂。诱导子-诱导子识别-酶合成-植物抗毒素合成,病原体释放的化合物或病原体部分细胞壁可以引起相似的应答。这些化合物称为诱导子，诱导生产植物抗毒素的过程称为诱导。除了致病源化合物外，还有一些协迫剂也可以诱导产物积累。协迫剂包括：紫外线、暴露于冷或热、乙烯、杀真菌剂、重金属盐或高盐浓度等。,生物转化,植物细胞培养中，酶的存在可以进行大量的反应。在特定的植物中，一般可以找到能够生物合成次生代谢产物的酶，在细胞培养时有可能使酶更具活性。细胞培养很重要的一个优点是可以生产纯的立体异构化合物。,通过加入便宜并且容易获得的前体物质，可以增加次生代谢物的产量。前体通过与在完整植株中相同的生物合成途径转化。然而，有时细胞培养将前体转化为另一种新的在植株中找不到的化合物。另一种是在细胞培养时加入一种不相关的化合物。细胞培养就有可能利用酶将这种不相关的化合物转化成另一种物质。这可被认为是化学合成中的一个步骤，而这个步骤在试管中是难以进行的，但在细胞内，由于有力的酶在作用而变得容易。,次生代谢物生产的一般步骤,高产细胞系的建立种子培养大规模培养（生物反应器）,植物细胞培养与微生物培养的不同特点,细胞大：20150m，是微生物细胞的10100倍。易成团。生长速度慢，增殖一代需1天到几天。不耐剪切。,复习思考题,何谓植物细胞培养？主要有哪些应用？何谓悬浮培养？简述其类型及各自特点？怎样测定细胞的增殖情况？植物细胞培养与微生物细胞培养有何不同特点？,