植物组织培养实验(1)(1).ppt

实验一1、培养基配制及其灭菌,（一）实验目的巩固培养基相关理论知识，掌握培养基配制方法及灭菌技术。,（二）实验原理培养基一般包括无机盐、有机化合物和植物生长调节剂三大基本组成成分。MS培养基是最常用的培养基。商品MS培养基已经包含无机盐、有机化合物、蔗糖和琼脂，只需按比例加水溶解，再加入所需的植物生长调节剂即可。各种植物生长调节剂一般配制成母液（0.1mg/ml或1mg/ml），冰箱贮存，使用时按浓度定量吸取加入。,培养基的pH值一般5.06.0，最常用的是5.65.8。大于6.0，培养基变硬；低于5.0，琼脂凝固不好。高压灭菌后稍有下降，所以灭菌前要略调高。一般用1mol/L的盐酸或氢氧化钠调节。配制好的培养基要及时灭菌，一般采用高压蒸汽灭菌，如含有高温不稳定的成分，如某些植物生长调节物质，则要采用过滤除菌。,（三）实验材料和用具 实验药品：MS培养基、1mg/ml NAA、1mg/ml 6-BA、1mol/L HCl、1mol/L NaOH、蒸馏水。实验用具：天平、烧杯、玻璃棒、量筒、移液枪、三角瓶、pH试纸、电炉、高压灭菌锅。,（四）实验步骤 配制以下培养基200ml：MS1：MS+1.0mg/LBA+0.5mg/L NAA称取8g MS培养基，加入200ml蒸馏水，加热直至完全溶解。依次加入 1mg/ml NAA 100l和 1mg/ml 6-BA 200l，并不断搅拌。用1mol/L HCl或NaOH调节pH至5.86.0。,分装。将培养基分装到8个50ml三角瓶中，培养基厚度约为5mm。做好标记。灭菌。用高压蒸汽灭菌锅在121、0.1MPa条件下灭菌1520min。操作按仪器操作步骤进行。灭菌后待压力下降到0Pa时取出，凝固后待用。,大容量高压灭菌器,全自动手提式灭菌器,（五）注意事项灭菌前应检查锅内是否加有足够的水，以免造成空烧或干烧。装锅不可过满，锅内应具有一定的空间，有利于蒸汽上下回流，保证灭菌效果。严格遵守灭菌压力和时间，灭菌时间过长或压力过高会影响培养基的有效成分，同时也使培养基pH发生较大幅度变化，灭菌时间过短或压力过低则达不到灭菌效果。只有当高压锅压力下降到0Pa后，才能开启压力锅，以免产生危险。,2、外植体灭菌及其初代培养物的建立,（一）实验目的通过外植体灭菌处理、无菌室外植体接种等无菌操作训练，掌握外植体灭菌的基本方法以及无菌操作技术，建立初代无菌培养体系。,（二）实验原理外植体都带有微生物，在组培过程中会造成污染，因此，外植体需经过严格的表面灭菌处理。一般采用各种灭菌剂进行外植体灭菌。灭菌后的外植体需在无菌条件下接种到培养基上。无菌操作所需的器皿、材料操作及操作环境均需无菌化。接种到培养基的外植体放在培养室里，提供一定的光照、温度和湿度，就可以建立起初代培养物的无菌体系。,当植株的其他部位难以消毒时，可以选用种子，消毒后的种子在无菌条件下播种到含有水琼脂培养基上或1/10 MS培养基上使其发芽。将无菌培养的幼苗切成小片，作为外植体。,（三）实验材料和用具 实验材料：黄瓜种子实验药品：灯用酒精、70酒精、95酒精、0.1氯化汞，吐温-80，无菌水。灭菌培养基：MS实验用具：无菌室、无菌滤纸、无菌培养皿、烧杯、解剖刀、镊子、剪刀、酒精灯、酒精棉花、滴管、记号笔、废液罐、火柴、光照培养箱。,（四）实验步骤 黄瓜种子投入95乙醇中浸泡30s，再转入小烧杯内的0.1氯化汞中（加12滴吐温-80），不断搅拌，消毒10min。进入无菌室，用70乙醇擦洗双手、盛放外植体的烧杯外壁和工作台面，点燃酒精灯。将烧杯中的氯化汞倒掉，加无菌水冲洗35次。夹取种子放入三角瓶内的培养基表面，每瓶放5粒，盖上盖子。注明标记。每组接种6瓶。光照培养箱25、60光照16h/d（箱内加水盆）培养。,作业,1周后观察灭菌培养基有无污染，计算污染率（染菌瓶数/总瓶数100），分析染菌原因。1周后观察初代培养体系有无污染，计算每一瓶内染菌外植体数和外植体外的菌落数，分析染菌原因。1周后观察种子发芽情况，计算发芽率（发芽种子数/种子总数100）。,附：参观无菌室,认识无菌室的结构使用注意事项,风淋室:风淋室是生物洁净室的理想配套设备，它不仅可以清除人体和物品表面附着的尘埃，减少带入洁净室的灰尘量，而且兼有气闸室的功能，可防止非洁净空气的侵入。风淋室的板壁采用轻质隔热夹芯钢板，吹淋板采用进口不锈钢制作，吹淋口方向可调，风淋时间可在30-99秒间的调整。风淋室可以配合加热器，冬天可以加热，温度可调，一般控制温度在30-35较为适宜。,传递窗:该装置是一种洁净室的辅助设备，主要用于洁净区与洁净区，洁净区与非洁净区之间小件物品的传递，以减少洁净室的开门次数，把对洁净区的污染降低到最低程度。PB系列传递窗按用途分为标准型和生物洁净型两种。（后者带空气自净装置）按门互锁形式分为机械互锁和电子互锁两种外壳按材料分为彩钢板型、薄钢板喷塑型和全不锈钢型三种通用型尺寸如下表所列，特殊规格按用户要求制作。,高效过滤器:高效过滤器是用超细玻璃纤维纸作滤料，胶板纸作分隔板，可与铝合金框、木框及镀锌钢板框组合而成。特点：具有低阻高效、轻质、容尘量大等特点，层高的要求，缩小净化设备静压箱体积等优点。适用于常温常压常湿条件下环境空气的净化，尤其适用于需要高效空气过滤器覆盖率高的净化厂房。,洁净层流罩:层流罩是可提供局部高洁净环境的空气净化设备。它主要由箱体、风机。初效空气过滤器、高效空气过滤器、阻尼层、灯具等组成，外壳为不锈钢或彩钢板。该产品既可悬挂，又可地面支撑，结构紧凑，使用方便。可以单个使用，也可多个联接组成带状洁净区域，形成洁净隧道。洁净层流罩是将空气经风机以一定的风压通过高效空气过滤器后，由阻尼层均压，使洁净空气呈垂直层流型气流送入工作区，从而保证了工作区内达到工艺所需的高洁净度。,出入制度,总体原则：进出净化室应按次序开、关门，只有将前面打开的门关闭后才允许打开下一个门，出入线路绝对不能逆行，使缓冲间起到应有的作用。层流净化细胞培养室共有两个缓冲间，进入每个缓冲间必须更换指定消毒的拖鞋。穿戴好消毒的鞋、帽、口罩后不得逆行离开层流净化室。,人流：打开细胞培养室外门，进入第一缓冲间，开灯，关闭细胞培养室外门,穿戴专用的洁净隔离衣、工作鞋帽、口罩等；打开第一缓冲间内侧门，进入第二缓冲间，新洁尔灭泡手1min，烘干，关闭第二缓冲间外侧门；打开第二缓冲间内侧门，进入层流净化细胞培养室,关闭层流净化细胞培养室外门。,物流：所有进出层流净化细胞培养室的物品均应通过传递窗进行；物品进入层流净化细胞培养室时，应先打开传递窗外侧门，将物品放入传递窗，关闭传递窗外侧门，打开紫外灯照射15min；人员进入层流净化细胞培养室后，关闭紫外灯，打开传递窗内侧门，取出物品；物品出室次序与以上进室次序相反，但不需紫外线照射。,实验报告内容,实验名称实验目的实验原理实验材料和用具实验步骤实验结果与分析,