09第九章 复制.ppt

DNA的生物合成(复制)DNA Biosynthesis（Replication）,第 九 章,中心法则（Central Dogma）,复制(replication)是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。,子链继承母链遗传信息的几种可能方式,全保留式 半保留式 混合式,一、半保留复制的实验依据和意义,DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全重新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。,半保留复制的概念,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,CCACTGG,GGTGACC,AGGTACTG,TCCATGAC,TCCATGAC,AGGTACTG,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,+,母链DNA,复制过程中形成的复制叉,子代DNA,目 录,密度梯度实验,实验结果支持半保留复制的设想。,含重氮-DNA的细菌,第一代,第二代,梯度离心结果,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的核苷酸序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。,半保留复制的意义,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,参与DNA复制的物质,底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):依赖DNA的DNA聚合酶，简写 为 DNA-pol模板(template):解开成单链的DNA母链引物(primer):提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合 其他的酶和蛋白质因子,二、参与DNA复制的主要酶类与蛋 白因子,（一）原核生物1 拓扑异构酶（topoisomerase）DNA拓扑异构酶主要有和两种类型。拓扑异构酶作用特点既能水解、又能连接磷酸二酯键,解链过程中正超螺旋的形成,目 录,拓扑异构酶是一类可改变DNA拓扑性质的酶。在DNA复制时，复制叉行进的前方DNA分子部分产生正超螺旋，拓扑异构酶可松弛正超螺旋，还可以引入负超螺旋，有利于复制叉的行进及DNA的合成。在复制完成后，拓扑异构酶又将DNA分子引入负超螺旋，有利于DNA缠绕、折叠、压缩以形成染色质。,型拓扑异构酶首先在大肠杆菌中被发现，称为拓扑异构酶，它可使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无需供给能量。另外，DNA复制时负超螺旋的消除，亦由拓扑异构酶来完成，但它对正超螺旋无作用。,型拓扑异构酶又称为旋转酶（gyrase），由两个A亚基和两个B亚基组成，即A2B2。它能使DNA的两条链同时发生断裂和再连接，当它引入负超螺旋以消除复制叉前进带来的扭曲张力时，需要由ATP提供能量。,目 录,拓扑异构酶,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。,拓扑异构酶,切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。,作用机制,2 解旋酶（helicase）,也称为解链酶，解旋酶解开DNA双链，但需要ATP水解供能，每解开一对碱基，需要水解2分子ATP。在原核生物中，解旋酶不止有一种。这说明不仅在复制过程中需要DNA解旋酶，在许多其它的过程，如转录、DNA修复、DNA重组中也同样需要。,3 单链DNA结合蛋白（single strand binding protein,SSB protein）大肠杆菌的SSB蛋白由4个相同亚基构成，其功能在于稳定解开的DNA单链，阻止DNA复性和保护单链部分不被核酸酶降解。原核生物的SSB蛋白与DNA的结合表现出明显的协同效应，SSB蛋白可以重复利用。,4 引发酶（primase）,又称引物合成酶，是一条分子量约为60ku的单肽链，每个细胞约有50-100个分子，该酶单独存在时相当不活泼，只有与其他蛋白质相互作用结合成一个复合体时才有活性，这种复合体称为引发体（primosome）。合成的引物是长约5-10个核苷酸的RNA。一旦RNA引物合成，就可以由DNA聚合酶在它的3-OH上继续催化DNA新链的合成。,DNA聚合酶是以DNA为模板，催化底物（dNTP）合成DNA的酶类，普遍存在于生物体内。它们的作用方式基本相同，都需要dNTP、Mg2+、模板DNA和引物，在DNA模板指导下，催化底物加到引物的3-OH上，形成3，5磷酸二酯键，由53方向延长DNA链。引物是DNA合成所必需的。,5 DNA聚合酶、（DNA polymerase、）,DNA聚合酶的功能如下：53聚合酶活性，当底物和模板存在时，DNA聚合酶可使脱氧核糖核苷酸逐个加到引物的3-OH末端的多核苷酸链上。53外切酶活性，它可以及时切除复制起始合成的RNA引物；35外切酶活性，起校对功能，它可切除聚合上去的错误的核苷酸，从而可使复制的忠实性提高1000倍。,3 5外切酶活性,5 3外切酶活性,?,能切除突变的 DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性,目 录,323个氨基酸（35ku),小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸(68ku),DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,DNA聚合酶为多亚基酶，由分子量约为88ku的多肽链组成，DNA聚合酶除具有53聚合酶活性外，也有35核酸外切酶活性，但无53外切酶活性。它也只是修复酶，而非真正的复制酶。,DNA聚合酶被认为是真正的DNA复制酶(replicase)，全酶由、等10种亚基组成，也含有锌原子，分子量大约900ku，以二聚体起作用。亚基主要有53聚合活性；亚基具有35核酸外切酶活性；2个亚基充当“滑动夹子”，它通过复合物夹子载体组装到DNA上，此步骤需要ATP。2个亚基围绕双螺旋形成一个环，以利于聚合酶沿着模板滑动。,功能是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。,DNA-pol,正是由于DNA聚合酶的组成复杂，使它具有了强催化活性、忠实性、持续性。DNA聚合酶可连续催化几千个磷酸二酯键的形成。所以它催化的合成速度达到了体内DNA合成的速度。它还有35核酸外切酶活性，使得复制的忠实性由710-6 提高至510-9，但DNA聚合酶无53外切活性。,大肠杆菌三种DNA聚合酶的性质比较,6 DNA连接酶（DNA ligase）,大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量约为74 ku的多肽，每个大肠杆菌细胞含有约300个连接酶分子。它催化双链DNA切口处的5-磷酸基和3-羟基生成磷酸二酯键，反应需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）提供能量，并释放出烟酰胺单核苷酸（NMN）。在真核生物中则需要ATP。DNA连接酶在DNA的复制、修复和重组等过程中均起重要作用。,（二）真核生物,1 拓扑异构酶（topoisomerase）真核生物的拓扑异构酶是分子量约为95ku的单体蛋白。虽然它所催化的反应与原核生物的酶相似，但它同样能使正、负超螺旋DNA松弛。松弛作用不依赖于ATP，能发生于有EDTA存在的条件下，Mg2+能提高该酶的活力。,拓扑异构酶为150ku-180ku的均二聚体，能以同样的速率松弛正、负超螺旋DNA；与原核生物不同的是，真核生物拓扑异构酶不能产生负超螺旋，发挥作用时需要ATP和Mg2+。,2 DNA聚合酶（DNA polymerase）DNA-pol 为多亚基酶，其中一个亚基具有引物合成酶活性，最大的亚基具有聚合酶活性，无外切酶活性的亚基。DNA-pol 既有持续合成DNA链的能力，又有校正功能，由它完成DNA的复制。DNA-pol 可能相当于细菌的DNA聚合酶，它是一种修复酶，参与DNA的修复合成，并存在于复制叉处，用以取代滞后链冈崎片段的引物。DNA-pol 也是修复酶。DNA-pol 是线粒体DNA的合成酶。,真核生物的DNA聚合酶,3 复制蛋白A（replication protein A，RP-A）是真核生物的单链DNA结合蛋白，其作用类似于大肠杆菌的SSB蛋白。4 复制因子C（replication factor C，RF-C）RF-C是夹子装置，相当于大肠杆菌的复合物，它控制滞后链上酶的结合与脱离。,原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。,三、双向复制,A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter),真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。,四、复制的半不连续性,前导链(leading strand),滞后链(lagging strand),顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为前导链。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为滞后链。复制中的不连续片段称为冈崎片段(okazaki fragment)。前导链连续复制而滞后链不连续复制，就是复制的半不连续性。,复制的化学反应,(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi,目 录,聚合反应的特点,DNA 新链生成需引物和模板；新链的延长只可沿5 3方向进行。,（一）复制的起始,需要解决两个问题：,1.DNA解开成单链，提供模板。,2.合成引物，提供3-OH末端。,五、原核生物的DNA生物合成,Dna A,Dna B、Dna C,DNA拓扑异构酶,引发酶,SSB,3,5,3,5,引发体和引物,含有解螺旋酶、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,3,5,3,5,引物是由引发酶催化合成的短链RNA分子。,引物,引发酶,（二）复制的延长,复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,OH 3,3,目 录,前导链的合成,目 录,滞后链的合成,目 录,