第二章 基因工程工具酶.ppt

第二章 分子克隆工具酶及其应用,分子克隆工具酶及其应用,限制性内切酶主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶用于DNA分子的甲基化 核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类-用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。,第一节 限制性内切核酸酶,一.限制性内切酶的发现 1.细菌限制修饰系统的发现 Werner Arber于1962-1968年发现，1968年分离到I型限制酶。2.限制酶HindII的发现 HOSmith 和Wilox 于1970年首次从流感嗜血杆菌（H.influenzae）中发现并分离到HindII限制酶。3.SV40 限制图谱和转录图谱的绘制 D.Nathans（1971年）用HindII绘制SV40的限制酶谱。,寄主的限制与修饰现象限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。,二.限制修饰系统的种类1.I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS（host specificity for DNA restriction modification and specificity）位于染色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（腺苷甲硫氨酸）。2.II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在.coli中这两种基因位于质粒上。3.III型：修饰酶与型酶相同，hsd与hsd基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。,限制性核酸内切酶的分类据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为、型三类。,三.限制性内切酶的定义、命名 1.定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II型限制酶。2.命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。例如：Hind前三个字母来自于菌种名称H.influenzae，“”表示菌系为型血清型；“”表示分离到的第三个限制酶。EcoRIEscherichia coli RI HindHaemophilus influensae d SacI(II)Streptomyces achromagenes I(),四限制酶的特点 1.识别顺序和酶切位点）识别-8个相连的核苷酸 MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC：PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC；SfiI GGCC N N N N N GGCC CCGGNNNNNCCGG Fok I 5-()9-3 3-()13-5 外侧，产生-端突起）富含,）对称性双对称 EcoRI 5-G A A T T C-3 3-C T T A A G-5）切点大多数在识别顺序之内，也有例外）限制酶切后产生两个末端，末端结构是-和-2.末端种类）-端突起，个数为或个核苷酸 Pst I 5-CTGCAG-3 5-CTGCA G-3 3-GACGTC-5 3-G ACGTC-5）-端突起，个数为或个核苷酸 EcoRI 5-GAATTC-3 5-GOH PAATTC-3 3-CTTAAG-5 3-CTTAAP HOG-5,）平齐末端 SmaI 5-CCCGGG-3 5-CCC GGG-3 3-GGGCCC-5 3-GGG CCC-5）非互补的粘性末端）切点在识别顺序之外的，如：FokI Fok I 5-GGATG()9-3 5-GGATG(N)9 3-CCTAC()13-5 3-CCTAC(N)13）能识别简并顺序的，如：AvaI AvaI 5-CPyCGPuG-3 CCCGGG;C TCGGG;CCCGAG;CTCGAG,）相容性末端如：BamHI G GATCC BglII A GATCT MboI,Sau3AI N GATCN 上述几种限制酶产生的DNA片段仍可相连，由此形成的重组分子能被MboI和Sau3AI识别和酶切，但BamHI和BglII的识别机率只有1/16。BamHI+MboI A/C/G/T GATCT/C/G/A BamHI和BglII(AGATCT)两种酶产生的相容性末端，相连后不能为两种酶所识别和酶切。BamHI+BglII A/G GATCT/C 不同末端的连接特性:除第4种末端不能进行不同DNA分子或同种DNA分子不同切点产生的末端相连外，其余4种末端可以相互连接。,五.异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）1.定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制 酶 2.特点：1）识别相同顺序 2）切割位点的异同 KpnI GGTAC C Asp718 G GTACC SstI CCGC GG SacI CCGC GG 限制酶的星反应（star activity）1.特点:限制酶识别序列特异性降低 2.发生星反应的限制酶和条件（见下页）3.星反应的利用和避免,1.限制性核酸内切酶的星活性(star activity)在极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能切割与特异识别序列相似的序列,降低酶切反应的特异性,这种改变的特殊性称为限制性核酸内切酶的星活性。产生Star活性后，不但可以切断特异性的识别位点，还可以切断非特异性的位点。产生Star活性的结果是酶切条带增多。,2.星活性产生的原因如下：反应体系中甘油的浓度大于5%。酶用量过大，大于100U/微克DNA。低离子强度，小于25mmol/L。高pH，大于8.0。含有机剂，如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙 酰胺等。Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二价离子的存在。常发生星活性的内切酶有：EcoRI、Hind、KpnI、PstI、SalI、HinfI等。,表1 具有星反应的限制性内切酶与条件限制酶诱发星活性的条件a识别序列AvaI 1,2,4BamHI 1-5,8 G GATCN,G PuATCCBstI 2,4BsuI 2,4,6EcoRI 1,2,4-6 N AATTNHae 2,4HhaI 2,4,7Hind 6HpaI 1,2,4PstI 1,2,4,7Pvu 2,4SalI 1,2,4,7ScaI 4-6,8 Sst 2,4XbaI 2,4,7a.1：亚乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(25U/g)；5：Mn+代替Mg+；6:pH8.5;7:二甲基亚砜(8%);8:无NaCl。,影响限制性核酸内切酶活性的因素DNA样品的纯度 DNA样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等,都有可能抑制酶活性。可采用以下方法，提高酶活性：加大酶的用量，1g DNA用10U酶加大反应总体积延长反应时间,DNA样品的甲基化程度大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤引入甲基，受其影响的酶有Bcl I Mbol 等，但BamHI、BglII、Sau3A I不受影响。大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等，但BglI、KpnI不受影响。采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA，可防止DNA的甲基化。,酶切反应的温度多数标准反应温度是37，如SmaI为25或30，SfiI为50。反应温度过度或过低都会影响酶活性，甚至导致酶失活。DNA分子结构 某些酶切割超螺旋质粒DNA时，酶量比切割线性DNA时高出多倍，可高达20倍。,核酸内切酶的缓冲液 高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的“星活性”现象。,限制性核酸内切酶操作的注意事项商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液，每次操作时应使用新的吸头去取酶，加入酶的体积应不超过总体积的10%，否则酶液中的甘油浓度超过5%时将会抑制酶的活性。整个操作应在0进行，即在冰浴中进行，而且是在加入其它试剂之后，最后加入酶。当切割大量DNA时，通常采用延长反应时间，减少酶的用量。当DNA需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液，若没有通用缓冲液时，只有用1种酶切完后，纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。,七.其它特异性的内切酶及其用途 1.末端酶（terminase）：5-GGGCGGCGACCTN-3 N-5，出现的频率约412 分子量为 117,000=1 A（74,000）+2 Nul（21,000）2.Omega核酸酶（I-SceI）：由内含子编码，用于rRNA的剪切，出现的频率约418=6.9 X 1010 bp，其识别顺序为 5-TAGGGATAACAGGGTAAT-3 TATT 3.I-PpoI：来自于Physarum polycephalum 识别序列：CTCTCTTAA GGTAGC AATT 4.用途 遗传标记，构建载体,八.限制酶的用途 1.DNA重组 2.限制酶（物理）图谱绘制 3.突变分析（RFLP分析）4.限制酶的部分酶切与完全酶切附：IIS型限制酶的特点 1.具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不具有对称结构。2.酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位点的一侧，1-20nt。3.酶切后的末端经补平后又可发生酶切反应。4.产生粘性末端可以是1-5个核苷酸。5.均为单体，分子量为47108 kD。,第二节 DNA 甲 基 化 酶,一.甲基化酶的种类与识别顺序 1.限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶 三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成5-甲基胞嘧啶和6-甲基腺嘌呤：在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。如：M.EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同 MHpaI C mCGG HpaI C CGG 相同,2.Ecoli 的dam、dcm甲基化酶 这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制修饰系统。dam G mATC，dcm C mCA/TGG 3.哺乳动物的甲基化酶 该酶可使CG中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反应与DNA复制、基因转录等过程有关。4.Ecoli中依赖于甲基化的限制修饰系统mrr（mA/A）、mcr(Am5CG)、merB（Pum5C）,二.甲基化酶活性对限制酶活性的影响 1.dcm 和dam甲基化酶对限制酶的影响 1）抑制某些限制酶的活性，不管两种限制酶的识别顺序是完全重叠还是边界重叠 如：完全重叠 BclIdam(GATC)；ScrFIdcm(CCA/TGG)边界重叠 ClaI-dam；Sau96I-dcm 2）不能抑制某些限制酶活性，不管两者的识别顺序为何种重叠 如：dam-BamHI，Sau3AI，BglII，PvuI；dcmBstNI,表2 对甲基化敏感的限制性内切酶限制酶 识别序列*甲基化酶Ava GG(A/T)CC(A/T)GG dcmBcl TGATCA dam Cla GATCGAT dam EcoR CC(A/T)GG dcmHph GGTGATC damMbo GATC damNru GATCGCGA damSau96 GGNCC(A/T)GG dcmSauF CC(A/T)GG dcmStu AGGCCTGG dcmTag GATCGA damXba TCTAGATC dam*下横线字母表示限制酶识别序列,绿色字母表示dam甲基化酶识别序列,红色字母表示dcm甲基化酶识别序列,2.II型甲基化酶对限制酶活性的影响）抑制同种限制酶的活性 M.BamHI GGATmCCBamHI(GGATCC)M.EcoRI GAmATTCEcoRI(GAATTC)）抑制不同种限制酶的活性 a.顺序完全重叠 如：M.ClaI（ATCGmAT）-TaqI（TCGmA）b.顺序边界重叠 如：M.BamHI（GGATmCC）-MepI（mCCGG）抑制不同种限制酶的部分活性 MTaqI（TCGmA）-HindII（GTPyPuAC）：GTCAAC，GTTAAC，GTCGmAC，GTTGAC 3.甲基化酶的用途）改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体的形成）在建立基因文库时，可先使DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切,表3 甲基化酶与识别序列甲基化酶 识别序列a 受甲基化影响的限制酶b M.Alu AGmCT Alu,BamH,Bsp1286 Dde,HgiA,Nhe,Pst M.BamH GGATmCC BamH,Msp M.Cla ATCGmAT Cla,Mbo,Taq dam GmATC c dcm CCA/TGG c M.EcoR GAmATTC EcoR M.HId GCNGC GGmCC Mst,Pst,Pvu M.Hae GGmCC Ban,Bgl,Bsp1286,BstX,Hae,Msp,Nae,Nco,Sac,Sau96 M.Hha GmCGC Aha,FnuD,Hha M.Hpa CmCGG Aha,Ava,Ava,Hpa,ScrF M.Hph TmCACC Hinf,Hph,Sau3A M.Msp mCCGG BamH,Msp M.Pst CTGCmAG Alu,Pst M.Taq TCGmA AluI,Ava,EcoRV,HinC,Hinf,Mbo,Taq,Xmna.标在碱基的左上角的m表示该碱基被甲基化;b.所列出的限制酶均已商品化;c.参见表2;d.M.HI分离自噬菌体污染的细菌细胞，它可识别两个序列，GCNGC的甲基化位点尚未确定。,第三节核 酸 酶,ds-DNA结构:切口,缺口,断口,一.外切酶III（ExoIII）1.一般特点：来自于E.coli，分子量28,000 kD 2.催化反应类型 1)外切酶活性：3 5，产生5-单磷酸核苷酸和具各种结构的 ds-DNA，pH 7.6-8.5 2)核酸酶H活性：除去DNA-RNA杂交分子中的RNA分子，pH 7.6-8.5 3)3-磷酸酶活性：除去3-磷酸基后形成3-OH端，有利于DNA聚合酶反应，pH 6.8-7.4 4)内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将DNA键切开，pH 7.6-8.5,3.外切酶活性特点 1)反应底物：互补ds-DNA 2)碱基释放速度：CA-TG 3)反应产物：5-单磷酸核苷和具缺口或5-端突起的ds-DNA，过度反应将导致DNA降解 4.用途 1)核酸（DNA）标记 2)基因突变-缺失 3)DNA序列测定时作顺序缺失 5.使用注意事项 1)正式使用前，测定在一定条件下酶的反应速度 2)在一定条件下，ExoIII不能作用GC富集区(来自于cDNA加尾),ExoIII的外切酶和RNaseH的作用,二.外切酶 1.反应特点 1)作用底物:要求5-PO4基;不作用含切口的DNA分子 2)作用方向与产物：5 3;产生5-P核苷和3-突起的ds-DNA 2.用途：DNA定序测定;除去5-端突起，产生3-端突起，便于加尾,三.核酸酶Bal31 1.一般特点：胞外酶；具DNase和 RNase 活性；由“快”和“慢”两种成分构成 2.催化反应特点 1)底物：ss-DNA，ds-DNA，RNA(外切与内切活性)2)作用方向与产物：5 3和3 5同时进行，但反应速度不同；产生5-单磷酸核苷和缩短的ds-DNA 3.用途：基因突变-缺失;绘制限制酶谱;DNA定序(与ExoIII相同)，其优点是Bal31酶活依赖于Ca+和Mg+，Ca+在反应完毕后可用EGTA（乙二醇四乙酸）灭活而不影响Mg+浓度，后者是限制酶活性必需的 4.使用注意事项：1)应作预备实验，因每批酶制品的“快”“慢”酶含量不同 2)DNA两条链碱基组成不同，终止反应时存在单链突起，需要补平,核酸酶Bal31的活性,四.核酸酶S1 1.一般特点：糖蛋白(含糖量8%)，最佳pH 4.5，对热稳定，抗变性剂 2.催化反应类型:ss-DNA;ss-RNA;双螺旋变性区 3.用途 1)基因突变-缺失，常与外切酶，如ExoIII、外切酶、Bal31连用 2)DNA定序分析 3)S1作图法 4)基因结构分析 5)tRNA结构分析 4.使用注意事项 1)避免长时间反应，因最适酸性pH将导致DNA断裂或降解 2)避免使用高浓度酶量，以免DNA被降解(因产生切口),核酸酶S1活性,五.绿豆核酸酶 1.与S1酶相同点：作用于ss-DNA和RNA，对5-端的突起核苷酸作用速度为GCAT 2.与S1酶的不同点 最适pH接近中性，不会产生切口;不使具切口的ds-DNA断裂 3.用途：与S1酶相同 六.外切酶 作用于ss-DNA的3-与5-端，产物为低聚核苷酸 除去单链DNA形成平整末端 七.牛脾磷酸二酯酶 作用含5-羟基端的ss-DNA和RNA，产生3-单磷酸核苷 用于短链RNA和 DNA的定序分析,八.蛇毒磷酸二酯酶 作用3-羟基单、双链DNA和RNA，产生5-单磷酸核苷 用于RNA和DNA的定序分析表4 几种常用外切酶的特点 外切酶 作用方向 作用底物 反应产物 ExoIII 35 dsDNA 单核苷酸 外切酶 53 ss和dsDNA 同上 Bal31 35和53 ss和dsDNA,RNA 同上 S1 35和53 ssRNA和ss DNA 低、核苷酸 绿豆核酸酶 35和53 ssRNA和ss DNA 同上 Exo VII 35和53 ssDNA 低聚核苷酸 牛脾磷酸二酯酶 53 ssRNA，ss DNA 同上 蛇毒磷酸二酯酶 35 ss，ds RNA和DNA 同上,九.RNase 大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA样品或蛋白质合成系统中的RNA分子。RNase的识别序列和特点见表5。1.RNase A分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂（100加热15min仍具活性）,用于除去DNA样品中的RNA分子 2.核酸酶S7，亦称微球菌核酸酶，对RNA敏感，用于除去蛋白质合成系统中的内源mRNA 十.RNase H 作用于DNA-RNA杂交分子中的RNA链，用于cDNA文库建立时除去DNA链以便第二条链cDNA链的合成。,十一.DNase I 1.特点：具内切酶活性，作用于ds-DNA，但无核苷酸序列特异型，产生5-P低聚核苷酸;Ca2+,Mg 2+或Ca2+,Mn2+可使酶活达最大值 当酶浓度很低时，ds-DNA分子上将形成切口，不同类型二价阳离子对两条链上切口位置形成有以下影响：Mg 2+存在时，两条链上的切口独立无关Mn2+存在时，两条链上的切口几乎在同一位置 2.用途 1)切口移位，制备DNA探针 2)制备RNA样品时除去DNA分子 3)基因突变时产生切口,第四节 DNA 聚 合 酶,一.E.coli DNA聚合酶I（polI）1.E.coli 的DNA聚合酶系统 Pol I 参与DNA修复,具35和53外切酶活性 pol II 同上 具35外切酶活性 pol III 参与DNA复制,具35和53外切酶活性 2.E.coli polI的特点 1）具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具53外切酶活性，大片段具35外切酶活性(大片段亦称为Klenow片段,polIK)2）聚合酶活性，53,要求3-OH引物和模板DNA，其延续性受反应条件的影响（表6）3）外切酶活性,3.用途 1）除去3-端突起的单链DNA（在无dNTP时）2）补齐5-突起端 3）合成第二条cDNA 4）切口移位制备探针 其中用途2)和3)常用大片段表6 E.coli DNA PolI 的延续性 DNA模板-引物类型 反应条件 延续性(碱基数)切口 ColE1 37C,低盐 8 缺口 ColE1 37C,低盐 47 切口/缺口胸腺DNA 37C,低盐 24 poly d(AT)37C,低盐 188 poly d(AT)5C,低盐 14 poly d(AT)5C,高盐 3,Klenow酶的基本用途修补经限制酶消化的DNA所形成的3隐性末端DNA片段的同位素末端标记cDNA第二链的合成双脱氧末端终止法测定DNA序列,二.T4 DNA聚合酶 1.特点：53聚合酶活性，1500 nt/min,为pol I的两倍 35外切酶活性，可作用于ss-DNA和dsDNA,其切除速度分别为40和 4000nt/min 2.用途：制备高比活性探针(1010 cpm/gDNA);DNA末端修饰-缺失,三.反转录酶(reverse transcriptase),反转录酶具有53的DNA聚合酶活性，以RNA为模板聚合cDNA链,同时又具有3 5和5 3的RNA外切核酸酶活性。AMV（鸟类骨髓母细胞瘤病毒）和MLV（鼠白血病病毒）。,双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链,四.Taq DNA聚合酶 1.特点：分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反应温度75，对95高温具良好稳定性，该酶不存在35外切酶活性 2.用途：主要用于DNA的体外扩增，经25次循环后才进入酶的反应稳定期，一个DNA 分子因而可被扩增4106倍 DNA扩增技术又称为聚合酶链式反应，它包括以下三个步骤：DNA模板变性(95)与DNA引物退火(45)引物延伸(75),Taq Pol 和PCR,五.T7DNA聚合酶,从感染了T7噬菌体的大肠杆菌寄主细胞中纯化出来的一种核酶。两种不同的亚基：T7噬菌体编码的基因5蛋白质和大肠杆菌编码的硫氧还蛋白。用途：大分子DNA合成；通过延伸或取代合成的途径标记DNA的3末端；标记5和3突出末端，转变成平末端结构。修饰的T7DNA聚合酶失去外切酶活性，但在单链模板上的聚合作用的速率增加了3倍，能有效地催化低水平的dNTPs(0.1umol/L)参入。而且能有效填补和标记具有5突出末端的DNA片段的3末端。,六.DNA定序酶 用基因工程方法去除35外切酶活性的Taq DNA聚合酶七.Tth DNA聚合酶 93kD，75，含有二级结构DNA分子的定序八.Tli DNA聚合酶 100仍具酶活，35外切酶活性，85 kD DNA的切平反应和补平反应 DNA聚合酶和核酸酶S1或绿豆核酸酶连用,可用于 DNA末端结构的修饰,切平反应和补平反应,四种不同补平反应,5-GGATCC-3 BamHI 5-G GATCC-33-CCTAGG-5 3-CCTAG G-5 dNTP dGTP dGTP/dATP dGTP/dATP/dTTP5-GGATC 5-GG 5-GGA 5-GGAT 3-CCTAG 3-CCTAG 3-CCTAG 3-CCTAG GATCC-3 GATCC-3 GATCC-3 GATCC-3 CTAGG-5 GG-5 AGG-5 TAGG-5 I S1 S1 S1 5-GG CC-3 5-GGA TCC-3 5-GGAT ATCC-3 3-CC GG-5 3-CCT AGG-5 3-CCTA TAGG-5 II III,小结：DNA聚合酶(DNA polymerase),第 五 节 RNA 聚 合 酶,一.SP6 RNA聚合酶 1、特点：依赖于DNA的RNA聚合酶，具SP6启动子特异型 2、用途：主要用于RNA分子的体外合成，RNA分子可用于：1）RNA分子的拼接研究 2）标记的RNA常用于杂交，RNA-DNA比DNA-DNA分子更稳定，两条链均可标记，产生的RNA具高放射比活性 3）DNA的定序分析 4）基因结构的研究，其中包括内含子数目，长度和位置 5）还可以用于蛋白质的合成研究,RNA聚合酶活性,二.T7 RNA聚合酶 特异性识别T7噬菌体基因启动子 三.T3 RNA聚合酶 特异性识别T3噬菌体基因启动子 基因启动子识别的特异性比较：SP6T7T3 四.E.coli RNA聚合酶五.多聚核苷酸磷酸化酶,第 六 节连 接 酶,DNA连接酶(DNA ligase)DNA连接酶能催化双链DNA切口处的5-磷酸根和3-羟基生成磷酸二酯键。这种反应需要供给能量，大肠杆菌和其他细菌的DNA连接酶以NAD+作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以ATP作为能量来源。,1.T4 DNA连接酶 1.特点：只连接ds-DNA分子，要求3-羟基和5-磷酸基 2.用途：1)相同或相容粘性末端的连接 2)平整末端的相连 DNA平端来源：限制酶作用结果;限制酶与其它酶共同作用结果。平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，所需的酶量也多 3.抑制剂：PO43-5mM,NaCl25mM,Ca+0.1mM,修复双链DNA缺口处的磷酸二酯键,修复与RNA结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键,连接多个平头双链DNA分子：,2、DNA连接酶的反应条件Tris-HCl 50-100mmol/L pH7.5MgCl2 10mmol/LATP 0.5-1mmol/LDTT 5mmol/LVolume 10-20LTemperature 4-15 Time 4-16h,3、平头双链DNA片段的连接操作 从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢的多。提高平头末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）。加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会。加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用。加入单价阳离子（NaCl）,最终浓度150-200 mmol/L。,平末端DNA片段的连接,同聚物加尾法衔接物连接法DNA接头连接法,二.E.coli DNA连接酶 只能连接具粘性末端DNA分子，以NAD作辅助因子三.T4 RNA连接酶参与单链RNA分子的连接。主要用于提高T4 DNA连接酶在连接反应中的连接效率（20倍）,