一种基于高分辨液质联用仪的%5E%2813%29C标记葡萄糖同位素丰度检测方法.pdf

化学试剂 第 卷第 期分析与测试一种基于高分辨液质联用仪的 标记葡萄糖同位素丰度检测方法范若宁赵雅梦王储尧廖望解龙赵诚罗勇雷雯(.上海化工研究院有限公司上海.上海市稳定同位素检测及应用研发专业技术服务平台上海.上海交通大学医学院 仁济医院 核医学科上海)收稿日期:网络首发日期:基金项目:国家重点研发计划项目()上海市稳定同位素检测及应用研发专业技术服务平台项目()作者简介:范若宁()女新疆伊宁人硕士助理工程师主要从事同位素分析检测方法开发通讯作者:赵雅梦:.雷雯:.引用本文:范若宁赵雅梦王储尧等.一种基于高分辨液质联用仪的 标记葡萄糖同位素丰度检测方法.化学试剂():摘要:葡萄糖是一种重要的同位素试剂在代谢组学等生物医药领域具有重要应用 开发了一种基于超高效液相色谱高分辨质谱联用仪的葡萄糖同位素丰度检测方法 在确定检测葡萄糖同位素丰度的适用条件后进行液质联用上机检测根据不同同位素标记模式峰的强度值进行丰度计算考察了样品浓度、质谱分析图数、流动相背景干扰对同位素丰度计算的影响在最优条件下取出峰时间窗口内所有质谱图并扣除流动相背景干扰后重复 次进样测得浓度为 /的葡萄糖试剂 丰度为 (理论值 )且 为 该方法无需复杂的前处理过程具有较好的准确性和稳定性是一种具有潜力的同位素试剂质量控制方法关键词:葡萄糖高分辨质谱同位素丰度检测中图分类号:文献标识码:文章编号:():./.(.):./().:自上世纪 年代提出人类基因组计划以来研究者们开启对生物学、生物信息学等生命科学领域的研究探索 近年来转录组学、蛋白组学、代谢组学等新组学技术不断涌现其中基于稳定同位素示踪的代谢流分析技术因其无辐射、高通量、高灵敏度等特点逐渐成为生物体内代谢物分析的重要手段已广泛运用于肿瘤代谢异质性、治疗新靶点及耐药性等研究中 葡萄糖作为示踪剂可示踪糖酵解、三羧酸循环、谷氨酰胺代谢等与肿瘤发生密切相关的关键代谢通第 卷第 期范若宁等:一种基于高分辨液质联用仪的 标记葡萄糖同位素丰度检测方法路是目前应用最为广泛的稳定同位素试剂葡萄糖同位素丰度值是否准确对于同位素示踪及后续的代谢流量计算都会产生较大影响因此准确、稳定的测定葡萄糖的 丰度值十分重要常用的同位素丰度检测方法有核磁共振波谱法和质谱法 核磁共振波谱法常用于氘标记化合物的丰度检测 等利用核磁共振法对 丙酮、重水等进行丰度测定测得氘丰度值与试剂标识值偏差 且相对标准偏差 具有较好的准确性和稳定性 质谱法主要包 括 气 体 同 位 素 质 谱 法、“质 量 簇”算法和高分辨质谱法 目前针对 标记葡萄糖同位素丰度的检测方法有气体同位素质谱法和“质量簇”算法气体同位素质谱法通过高温燃烧将样品中的、元素转为气体而进行检测但同时也会对样品杂质中的碳元素进行转化因此在适用性上具有一定的局限性“质量簇”算法是根据样品的同位素标记信息联立方程组计算同位素丰度 陈燕秋等建立了基于气相色谱质谱联用仪的 标记葡萄糖丰度检测方法结合“质量簇”算法测得 丰度值为 且 为 具有较好的准确性与稳定性但此方法需对葡萄糖衍生化不具有便捷性 高分辨质谱具有高灵敏度及超高分辨率可检出化合物多种同位素标记模式因此在同位素丰度检测方面具有独特优势 田甜等采用四极杆轨道阱高分辨质谱仪建立了氘标记试剂同位素分布及丰度的检测方法适用于所有同位素偏差小于仪器偏差的氘标记试剂检测该方法采用流动注射进样方式能够快速检测氘标记同位素分布且所测丰度值与证书标识偏差低于 但对于同位素标记化合物检测方法尚未进行系统的研究 本文采用高分辨质谱仪结合液相色谱通过考察检测适用条件、样品浓度、质谱扫描次数及流动相干扰影响等方面建立 标记葡萄糖同位素丰度检测方法并对不同丰度的 标记葡萄糖样品进行丰度测定为同位素试剂的质控提供了一种简便、准确的检测方法 实验部分 主要仪器与试剂 型高分辨液质联用仪(美国 科技有限公司)型电子天平仪(瑞士 集团)型涡旋仪(中国其林贝尔仪器制造有限公司)型超纯水系统(德国 公司)葡 萄 糖(纯 度 丰 度)、葡萄糖(纯度 丰度)(美国剑桥实验室)乙腈(质谱级美国 科技有限公司)超纯水由超纯水系统所制 实验方法 标准溶液配制称取适量葡萄糖加入 乙腈水溶液涡旋 充分混匀 配制成浓度为 /的储备液 准确移取适量储备液用 乙腈水溶液稀释成 /以及、/的工作标准溶液 储备液和工作标准溶液均保存于 不同 丰度葡萄糖溶液配制称取适量葡萄糖加入 乙腈水溶液涡旋 充分混匀配制成浓度为 /的储备液不同 丰度葡萄糖样品由葡萄糖溶液与葡萄糖溶液混合制成 准确移取 葡萄糖储备液和 葡萄糖储备液用 乙腈水溶液稀释成 /的样品溶液 准确移取 葡萄糖储备液和 葡萄糖储备液用 乙腈水溶液稀释成 /的样品溶液 准确移取 葡萄糖储备液和 葡萄糖储备液用乙腈水溶液稀释成 /的样品溶液 储备液和样品溶液均保存于 检测条件色谱柱:色谱柱()流动相:流动相 为含 氨水和/乙酸铵的水溶液流动相 为乙腈洗脱条件:等度洗脱 流速:/柱温:质量检测器:离子源:电喷雾电压():鞘气():辅助气():离子传输管温度:汽化温度:扫描模式:负离子模式全扫描分辨率:扫描范围:化学试剂 第 卷第 期 结果与讨论 标记葡萄糖同位素丰度计算本文采用液相色谱高分辨质谱联用法对葡萄糖同位素丰度进行测定图 为葡萄糖的提取离子流图提取出峰窗口叠加质谱图中的各同位素标记模式的峰强度(图)计算其.葡萄糖提取离子流图.标记葡萄糖质谱图图 标记葡萄糖同位素丰度计算示意图.同位素分布再根据/标准进行同位素丰度计算 高分辨质谱仪用于葡萄糖 丰度计算的适用条件葡萄糖样品中可能含有多种 标记形式的化合物如葡萄糖、葡萄糖等因此在质谱 条件下也会有相应、等一系列的分子离子峰且各化合物自身天然同位素丰度也可能会造成干扰 根据 数据库查询上述化合物分子离子峰及干扰峰的准确质量数如表 所示采用公式()计算相对同位素偏差()范围为 ()/()其中:为标记化合物分子式 为同位素表记个数表 葡萄糖相对同位素偏差.分子离子峰质荷比干扰峰质荷比差值 尽管高分辨质谱在同位素分布和丰度检测上具有很大的优势但仪器系统误差仍无法避免采用上述方法对目标物进行多次测量仪器所得葡萄糖 标记模式的分子离子峰与理论值的偏差即 为 仪 器 质 量 偏 差()根据公式()计算仪器质量偏差范围为 ()/()其中为仪器实测葡萄糖的精确质荷比为待测化合物的理论质荷比表 高分辨仪器质量偏差.理论质荷比(/)实际检测质荷比(/)田甜等研究表明当 大于 时表明仪器质谱分辨率能够分辨各同位素标记模式的干扰峰 本实验中葡萄糖样品各同位素标记模式的 均大于 因此高分辨质谱可用于葡萄糖的 丰度检测 葡萄糖同位素丰度结果影响因素 样品浓度由于葡萄糖在质谱检测上存在离子化效率低等特点当葡萄糖样品浓度过低时部分 标记模式无法检出而造成同位素丰度结果存在偏差因此选择合适的样品浓度是丰度检测准确的关键因素 本文分别选择对浓度为/以及、/的葡萄糖工作标准溶液进行检测同位素丰度结果如图 所示当检测对象为 /、/的低浓度样品时除 全标记以外的同位素标记模式无法检出且计算 丰度值为 随着样品浓度的增大 丰度值也随之降低样品浓度增至 /及以上时检出 标记形式的分子离子峰也随之增多且 丰度值趋于稳定因此认为检测样品浓度为 /及以上时该第 卷第 期范若宁等:一种基于高分辨液质联用仪的 标记葡萄糖同位素丰度检测方法方法测得 丰度值更为准确后续实验均采用/的工作溶液进行检测图 不同浓度的葡萄糖同位素丰度结果.质谱图张数本研究通过提取目标物出峰时间窗口内的叠加质谱图进行 丰度分析因此质谱图张数也是影响同位素丰度计算结果的因素之一 如图 所示分别在出峰时间窗口()内取、张质谱图进行同位素丰度计算结果如表 所示不同叠加质谱图数的同位素丰度范围为 数据变化较小由于质谱检测存在系统误差多次测量的平均值更具有准确性因此本研究选择取出峰时间窗口内所有质谱图进行 丰度分析表 质谱分析张数对葡萄糖同位素丰度值结果.质谱分析图数时间窗口/流动相背景干扰目标物随着流动相共同进入质谱分析因此流动相背景干扰也是影响小分子化合物同位素丰度准确计算的一个关键因素 对纯流动相和葡萄糖分别进行质谱采集采用仪器自带软件 对样品质谱数据进行背景扣除()图 为扣除背景前后葡萄糖的质谱图对比可以看出背景扣除前在质量范围/内目标物的质谱信号被流动相所掩盖而进行背景扣除后葡萄糖质谱图中杂峰峰数量减少且可以对部分受背景干扰的目标物分子离子峰如(/)、(/)等进行质谱信号比例校正 丰度值计算结果如表 所示对葡萄糖重复进样 次仪器测得 同位素丰度值为 且 为 基 本 符 合 理 论 值()表明该方法具有较好的 丰度检测准确性及稳定表 扣除流动相背景前后葡萄糖同位素丰度结果.序号扣除背景后扣除背景前/.背景扣除前的质谱图.扣除背景后的质谱图图 葡萄糖背景扣除前后质谱图对比.方法应用应用本研究所建立的方法对 种不同丰度的 标记葡萄糖样品、进行 丰度测量化学试剂 第 卷第 期对样品出峰时间窗口内所有质谱图进行叠加分析并扣除流动相背景其检测结果如表 所示测得 种 样 品 丰 度 结 果 为 、且 由于葡萄糖试剂和葡萄糖试剂具有自身纯度及同位素丰度值且 种样品均由储备液混合制成配制过程中会产生一定的误差因此校正后 种样品的 丰 度 理 论 上 均 应 分 别 大 于 、本方法检测结果基本符合理论值该方法具有一定的准确性及稳定性表 标记葡萄糖样品 丰度值检测结果.检测对象/样品 样品 样品 结论本文建立了基于高分辨液质联用仪的 葡萄糖同位素丰度计算方法该方法具有良好的准确性精密度优于 并且所需样品用量少无需进行衍生化等前处理 此外本方法将色谱的分离富集与高分辨质谱检测的高精度相结合可用于多种化合物同位素丰度的同时测定克服了传统方法上采用流动注射进样方法的局限性具有良好的应用前景参考文献:.():.():.李文杰胡泽平.代谢流分析在肿瘤代谢研究中的应用进展.中国医学前言杂志():.:.():.():.:.():.():.侯捷雷雯杜晓宁.液相色谱质谱联用法测定动物血浆中 标记氨基酸的同位素丰度.化学世界():.侯捷雷雯杜晓宁.气相色谱质谱联用法分析标记精氨酸发酵液中的氨基酸组分及其同位素丰度.分析测试学报():.陈燕秋侯捷雷雯.气相色谱质谱联用法检测标记葡萄糖的同位素丰度.同位素():.():.解龙宋明鸣雷雯.高分辨气体同位素质谱法测定重水的氘同位素丰度.化学试剂():.田甜刘书妤李双青.高分辨质谱测定氘标记化合物同位素分布与丰度的方法研究.分析化学():.中华人民共和国工业和信息化部.稳定同位素氘标记试剂卤代苯的同位素丰度测定 气相色谱质谱联用法:/.北京:化学工业出版社.