新冠抗体检测技术进展及在防控工作中的应用.pdf

热点聚焦248JiangsuJPrevMedVol.34,No.3江苏预防医学2 0 2 3年5月第34卷第3期新冠抗体检测技术进展及在防控工作中的应用许果1，董晨2，田华，李楚楚，孔筱筱，李志锋，彭杰夫”，储金金，许可，胡建利，鲍倡俊，朱立国 21.南京医科大学公共卫生学院，江苏南京2 10 0 0 0;2.江苏省疾病预防控制中心摘要：新冠病毒为线性单股正链RNA病毒，从2 0 19年底出现以来，全球持续关注新冠病毒变异及流行情况。快速、准确识别病毒感染者，对控制疫情的蔓延极为重要。抗体检测作为一种临床辅助诊断手段，对核酸检测起到了很好的补充作用，可应用于人群感染监测和疫苗免疫后效果评估。现对新冠抗体检测技术进展作一综述，并对不同技术在江苏省新冠防控工作中的应用进行分析，为抗体检测技术更好地应用提出建议关键词：新型冠状病毒；特异性抗体；中和抗体；检测技术；防控应用中图分类号：R392-3文献标识码：A文章编号：10 0 6-90 7 0(2 0 2 3）0 3-0 2 48-0 4Progress in antibody detection technology of SARS-CoV-2 andits application in prevention and controlXU Guo*,DONG Chen,TIAN Hua,LI Chu-chu,KONG Xiao-xiao,LI Zhi-feng,PENG Jie-fu,CHU Jin-jin,XU Ke,HU Jian-li,BAO Chang-jun,ZHU Li-guo*School of Public Health,Nanjing Medical University,Jiangsu Nanjing 210000,ChinaAbstract:SARS-CoV-2 is a linear positive single-stranded RNA virus,since its emergence at the end of 2019,the world has con-tinued to pay attention to the variation and circulation of SARS-CoV-2.Rapidly and accurately identifying the infected cases is crucialfor controlling the spread of the pandemic.Antibody detection technology,as a clinical auxiliary diagnostic tool,has played a good com-plementary role for nucleic acid test,and can be applied to the population infection monitoring and post vaccine immunization effect e-valuation.This article reviews the progress in antibody detection technology of SARS-CoV-2,and describes the application of differenttechnologies in the prevention and control of COVID-19 in Jiangsu Province,so as to provide suggestions for better application of anti-body detection technology.Keywords:SARS-CoV-2;Specific antibody;Neutralizing antibody;Detection technology;Prevention and control application目前，新冠病毒变异及流行情况受到全球持续关注1-2 。新冠病毒经历从野生株到Omicron毒株的进化过程，传播能力增强，给阻断病毒传播带来了难度。快速、准确地识别病毒感染者成为控制疫情传播的关键，核酸检测、抗原检测和抗体检测是3种应用最为广泛的技术。核酸检测需要专业人员在特定实验室进行，且采样后需要冷链运输，标本处理、核酸提取和RT-PCR扩增的全部流程至少需要2 h才能获得结果。而抗体/抗原检测可由非专业人员经简单操作，最快15min内即可直接获得结果，适用场景更广。2020年3月3日，新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）首次将抗体检测纳人临床辅助诊断标准，对核酸检测起到了很好的补充作用；之后，新冠抗体检测在人群免疫后常态化防控中也发挥了重要作用。2 0 2 0 年初，江苏省组建了新冠感染者和疫苗免疫后人群队列，通过新冠抗体的系列检测，掌握了新冠病毒感染和免疫后抗体消长规律，在辅助识别个体感染史和精准防控方面做出巨大的贡献。本文主要对抗体检测技术进展作一综述，并对不同技术在江苏省新冠防控工作中的应用进行分析，为抗体检测技术更好地应用提出建议。1抗体检测指标新冠病毒为线性单股正链RNA病毒，由刺突（s p i k e,S）蛋白、包膜（envelope，E）蛋白、膜（membrane，M）蛋白和核衣壳（nucleocapsid,N）蛋白等4种结构蛋D01:10.13668/j.issn.1006-9070.2023.03.002基金项目：江苏省卫生健康委科研重点项目（DX202301）；省333重点行业领域人才项目；江苏省卫生健康委科研项目（Z2020050）；江苏省社会发展项目（BE2021739）作者简介：许果（1999一），女，湖南娄底人，硕士研究生在读，研究方向：急性传染病预防与控制；董晨（198 1一），女，江苏南京人，主任技师，主要从事急性传染病预防与控制工作。为并列第一作者通信作者：朱立国，主任医师，E-mail：z h u l i g u o 2 0 0 2 16 3.c o mJiangsuJPrevMed,MaVol.34,No.3249.江苏预防医学2 0 2 3年5月第34卷第3期白及RNA依赖性的RNA聚合酶组成。抗原表位主要分布于S和N蛋白上。个体在感染新冠病毒或接种疫苗后，产生许多针对病毒不同表位的特异性抗体，其中大部分抗体的结合表位对病毒进入细胞并非必需，如N蛋白位于病毒内部，无法与细胞外的抗体结合;E蛋白和M蛋白不参与病毒结合细胞表面受体并侵人细胞内部的过程，因此针对其的特异性抗体均不能阻止病毒侵人细胞。仅少数抗体能够有效中和病毒，称为中和抗体（neutralizingantibody，NA b），如S蛋白通过识别体细胞表面受体结合域（receptorbindingdomain,RBD)而结合宿主靶细胞表面的血管紧张素转化酶2（angiotensin-converting enzyme 2,ACE2）受体，从而进人细胞体内进行病毒复制，最后破坏宿主细胞3。因此,针对S蛋白表位的特异性抗体可以识别并结合S蛋白，阻断病毒与ACE2结合，从而减轻或消除病毒对人体的危害4-5,是具有中和病毒作用的中和抗体。理想的血清学检测方法应测量个体内的中和抗体水平，但对实验室和人员设备的要求极高，且过程繁、耗时长，难以普及。研究表明,抗S蛋白RBD的IgG水平与病毒中和抗体水平具有显著相关性6-7 。IgG、Ig M 检测技术比较成熟，且操作简单，适合在基层机构中开展。检测急性期和康复期患者或是疫苗接种者血清中的抗体水平，也可以很好地反映其中和抗体水平，用以评估新冠病毒感染的发展或免疫接种的保护效果8-9。主要通过检测特异性抗体IgM、Ig G、Ig A、中和抗体的存在及水平，间接判断病毒感染情况。由于感染者血液中特异性抗体在核酸转阴后很长一段时间内可继续存在，对于疫情回顾性诊断和流行病学调查具有重要的价值。但是，由于抗体检测的准确性与试剂盒的制备密切相关，且在感染早期无法检出，加之受血液样本中的干扰物质（如类风湿因子、甲胎蛋白、补体、溶血所致的高浓度血红蛋白、细菌污染等）的影响，可能出现“假阳性”结果。新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第八版）中指出：对疑似病例单独采用抗体检测进行病例确诊和排除时，解读结果需谨慎，应结合患者流行病学史、是否接种 SARS-CoV-2疫苗及是否合并免疫相关基础疾病等信息进行综合研判。2抗体检测方法及特点常用的SARS-CoV-2抗体检测商品用试剂盒主要选择刺突蛋白S和核衣壳蛋白N作为包被抗原10),随着抗体检测技术的发展，一系列准确、快速地中和抗体高通量检测技术建立起来，并应用到新冠抗体检测工作中。本文主要介绍3种常用的特异性抗体检测方法以及3类中和抗体检测技术。2.1特异性抗体检测方法及特点2.1.1胶体金免疫技术法（colloidalgold immune，CGI)作为免疫层析法其中的一类，以胶体金作为示踪标志物，能够快速检测样本中总抗体、IgM、Ig G，一般用于定性判断。该方法无需特殊处理标本，操作简单，仅15min就可通过肉眼观察检测结果，对检测人员的专业性、场所的适用性无特定要求。考虑其弱阳性结果受主观影响较大，且相对于其他技术敏感性偏低、特异度居中，且只能进行单样本判读，一般只作为疑似病例的初步筛查，后续需联合其他检测手段进一步诊断2 2.1.2酶联免疫吸附试验法（enzyme-linked immu-nosorbentassay,ELISA）一种结合免疫反应和酶测定的高敏感性免疫学实验技术，可用于检测血液中总抗体、IgM、Ig G、Ig A，根据显色的深浅程度进行半定量或定性分析，是一种中等通量的检测手段，可在2 h内完成13。具有较好的灵敏度和特异度，但ELISA试剂盒检测步骤较为繁琐，需要熟练的人员进行操作使用设备、解释和报告结果，且检测速度较慢。2.1.3化学发光免疫分析法（chemiluminescent immu-noassays,CLIA)将化学发光测定技术与免疫反应相结合，用于定量检测血清中的IgM、Ig G、Ig A、总抗体。比CGI和ELISA法具有更高的敏感性和特异性，分析时间比ELISA短，从15min至数小时不等，操作简单、自动化程度高，适用于高通量样本检测。近年，纳米技术在CLIA得到了广泛应用，通过放大发光信号加速了CLIA的快速发展13。但由于需要配套特定化学发光仪器，不适合现场检测。对于具备检测能力的单位，CLIA法检测准确性优于CGI和ELISA法。2.2中和抗体检测方法及其特点2.2.1病毒微量中和抗体试验（microneutralizationtest，MNT)是评估中和抗体水平的金标准。目前尚未开发商品试剂盒，价格昂贵且耗时较长（约1周）；检测需要培养活病毒，因此新冠抗体MNT要求在生物安全三级实验室内进行操作，对专业人员素质要求较高，全国范围内满足该要求的实验室屈指可数。另外，由于不同实验室使用的病毒株、培养条件和结果判读标准存在一定差异，活病毒检测结果常难以直接比较，只用于小范围的疫苗效果评估，不适于大规模血清检测。近年来，替代病毒中和试验（surrogate virus neu-tralizationtest,sVNT)方法应运而生，基于中和抗体能够阻断ACE2受体蛋白与受体结合域之间相互作用的原理，不需要任何活病毒或细胞，就可以检测到中和抗体，可在生物安全二级实验室内进行操作，最短12h即可完成检测14O2.2.2假病毒中和试验（pseudovirion-based neutralization250JiangsuJ PrevMed,MayVol.34,No.3江苏预防医学2 0 2 3年5月第34卷第3期assay,PBNA)通过构建慢病毒载体包装体系（如HIV-1)或水疱性口炎病毒包装体系（vesicular stomatitisvirus,VSV）,尽可能地模拟病毒人侵过程。由于假病毒进人人体后只能完成单个复制周期，具有较高的安全性，可在生物安全二级实验室内开展试验，耗时约3d。目前尚无相应的商品试剂盒,且结果相对新冠活病毒有一定差异15,和MNT一样多用于疫苗效果评估。本课题组前期以6 4例新冠病例为研究对象，采集早期和随访血清样本117 份，采用MNT试验、PBNA试验进行测试，新冠感染者PBNA试验结果相对于MNT试验的相关系数为0.7 6 0；当MNT试验的临界值取为1:10 时（小于1:10 判定为阴性）,PBNA检测方法的Cutoff值为50 时，受试者工作特征（receiveroperatingcharacteristic,ROC）曲线下面积为0.90 1，表明PBNA试验具有科学性和可行性【16 2.2.3竞争抑制试验作为sVNT中的一类，包括ELISA试验和CLIA试验；检测原理是基于中和抗体竞争性结合RBD蛋白，从而抑制试剂盒中RBD与人血管紧张素转化酶 2(human Angiotensin converting en-zyme2,hACE2）结合，特异性较高、检测速度快。目前，国内已经有多家商家生产试剂盒，需要配备专门的检测仪器，实现半自动或全自动操作，生物安全二级实验室即可满足检测需求。本课题组采用ELISA试验和CLIA试验进行6 4例新冠感染者竞争抑制试验，相对于采用MNT试验结果相关系数分别为0.7 7 8 和0.7 2 5，当MNT试验的临界值取为1:10、ELISA检测的Cutoff值为1：8 时，ROC曲线下面积为0.934；CLIA检测的Cutoff值为1.2 8AU/mL时，ROC曲线下面积为0.8 38；提示上述高通量检测方法均可作为新冠疫情常态化防控中的检测技术手段16 。另外，与MNT试验相比，采用ELISA的竞争抑制试验在社区健康人群中检测新冠病毒中和抗体时，灵敏度为95.0%，特异度为10 0.0%,Kappa值高达0.96 2 17 。因此，相对于MNT试验和PBNA 试验而言，竞争抑制试验更适用于大规模人群血清中和抗体水平的测定。3新冠抗体检测的应用价值3.1辅助诊断新冠感染虽然病毒核酸检测是判定新冠感染的直接证据，但通常要在发病初期的1 2 周内检出，且感染中后期检出率也会有所降低。新冠病例在发病后1周内即可检测到特异性IgM抗体,3 4周时阳性率达到最高；平均在发病后12 14d可检出特异性IgG抗体，可用于判断近期或既往感染，不宜用于早期感染诊断。联合使用血清学检测和核酸检测，可以增加感染者的检出率。IgA抗体分布于血清和黏膜，在局部免疫机制中发挥作用。感染后，病例血清RBD-IgA可能比anti-RBDIgG更早检出,且在感染后1周内的阳性率高于50.0%，且高于IgM和IgG；第2 3周阳性率可达100%18-91。因此，联合IgA、Ig M 和IgG抗体检测可有效降低漏检率2 0 本课题组通过比较OmicronBA.2免疫突破病例和灭活疫苗免后人群的抗体滴度，发现免疫突破病例血清IgA和IgG滴度分别是灭活疫苗免后人群的8 25和9 2 2 倍，且免疫突破病例血清IgA和IgG滴度与感染时长存在一定的线性关系2 1。使用CLIA 检测特异性抗体IgA时，当IgA的Cutoff值取1S/CO,ROC曲线下面积为0.7 44，进一步确定了IgA抗体水平在识别突破性病例和免疫后健康人群中的作用2 。自最后1剂疫苗接种后,相对于OmicronBA.2变异株免疫突破感染人群，疫苗免疫健康人群中和抗体水平持续低于前者，免疫突破感染人群中和抗体滴度比免后组高6.4倍。当中和抗体取6 4AU/mL时，ROC曲线下面积是0.7 2 8，提示中和抗体测定可用于从免后人群中识别突破性感染病例2 33.2人群新冠抗体水平动态调查针对新冠感染者和疫苗免疫后人群队列，通过新冠抗体的系列检测能掌握新冠病毒感染和免疫后抗体消长规律3.2.1自然感染人群抗体水平动态变化2020年1一3月江苏省新冠病毒野生株感染者首次随访结果显示：康复6 个月后，IgG阳性率仍为7 8.13%，与出院时相比差异无统计学意义；而IgM、Ig G、中和抗体水平均有所下降，提示感染者虽然具有较长时间的免疫保护水平，但无法长期维持抗体水平2 4，需要疫苗接种来加强免疫；2 0 2 1年第2 轮随访结果显示：症状发生后第15 16 个月，接种1剂次疫苗者的IgG抗体、中和水平明显高于未接种者，但差异无统计学意义，第1718个月的抗体水平高于未接种者，差异有统计学意义，且接种1剂次、采样时间与接种时间大于14d康复组的IgG、中和抗体水平与接种2 剂次康复组相当，表明康复者接种1剂次疫苗产生的抗体水平具有较好的保护能力2 5。病例血清IgA滴度会在发病后3周内上升，然后下降，1个月后无法检出19。2 0 2 1年89月南京和扬州市新冠肺炎疫情中的Delta自然感染人群IgG水平在感染后2 周内逐渐上升，3 7 周后逐渐下降2 6 。另1项研究发现,Delta株自然感染人群中和抗体水平在发病或感染后第3周开始迅速增加，第3周后中和抗体水平呈持续缓慢上升趋势2 7 。3.2.2免疫后健康人群、免疫突破人群抗体水平动态变化及差异本课题组前期研究显示，新冠灭活疫苗免疫人群IgG抗体水平在接种后3个月内快速下编辑：彭海燕Jiangsu J Prev Med,Mayol.34,No.3251江苏预防医学2 0 2 3年5月第34卷第3期降,3个月后缓慢下降,并保持在较低水平2 6 。2 0 2 1年58 9例Delta株免疫突破病例IgG抗体水平在突破感染后2 周内快速上升，在37 周后逐渐下降2 6 ，Delta株免疫突破病例中和抗体滴度在感染后第2 周达到峰值，第3 7 周抗体水平基本稳定。OmicronBA.2突破性感染者的中和抗体水平显示，中和抗体滴度在症状出现后的第2 周开始增加,第4周达到峰值，此后有所下降，恢复期的中和抗体滴度是急性期的 10.9 倍2 7 O综上，不同抗体检测技术应用场景、要求、检测时间和检测能力均有所不同，应根据需求选用适合的技术和方法，作为核酸检测方法的补充，辅助新冠感染诊断，以期更高效、快速获取结果，为制定防控政策提供科学依据。抗体检测还可用于群体抗体水平调查，用于了解病毒感染过程、机理和免疫后效果评估，对常态化防控的政策制定具有指导意义。参考文献1冯哗因，宋洋，王世文，等.全球新型冠状病毒变异株研究进展J.病毒学报,2 0 2 1,37(3)：6 95-7 11.2WHO.Weekly epidemiological update on COVID-19 EB/OL.(2023-04-23）2 0 2 3-0 4-2 7 .h t t p s :/w w w.w h o.i n t/p u b l i c a t i o n s/m/item/weekly-epidemiological-update-on-covid-19.3Hoffmann M,Kleine-Weber H,Schroeder S,et al.SARS-CoV-2 CellEntry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a ClinicallyProven Protease Inhibitor J.Cell,2020,181(2):271-280.e8.4Jiang S,Hillyer C,Du L.Neutralizing Antibodies against SARS-CoV-2and Other Human Coronaviruses J.Trend Immunol,2020,41(5):355-359.5Li Q,Wu J,Nie J,et al.The Impact of Mutations in SARS-CoV-2Spike on Viral Infectivity and AntigenicityJ.Cell,2020,182(5):1284-1294.e9.6Peterhoff D,Gluck V,Vogel M,et al.A highly specific and sensitiveserological assay detects SARS-CoV-2 antibody levels in COVID-19patients that 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