江南大学开放实验讲 义.doc

江南大学国家生命科学与人才培养基地 开 放 实 验 讲 义 生物工程学院 2004.12 目 录 实验讲义 第一部分 啤酒工艺综合实验 实验一 还原糖的测定 3 实验二 α-氨基氮的测定（茚三酮法） 4 实验三 双乙酰（紫外分光光度法） 5 实验四 总酸（电位滴定法） 6 实验五 酒精度 7 实验六 原麦汁浓度（蒸馏——密度法） 9 实验七 真正发酵度(实际发酵度) 10 实验八 协定法糖化和外加酶糖化法 11 第二部分 通风发酵综合实验 实验一 淀粉质原料的水分测定 12 实验二 原料中粗淀粉的测定 13 实验三 还原糖的测定 17 实验四 蛋白酶活力的测定方法 19 实验五 糖化酶的测定方法 22 实验六 玉米淀粉液化及糖化 24 实验七 面包酵母流加培养与分批培养试验 27 实验八 糖化酶的发酵和提取实验 31 实验九 酸性蛋白酶固态发酵实验 34 第三部分 分子生物学实验 实验一 质粒DNA的提取、电泳鉴定 35 实验二 嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶基因的PCR扩增，PCR产物的纯化 36 实验三 感受态E.coli JM109制备 37 实验四 PCR产物和载体的酶切连接 37 实验五 质粒转化与转化子鉴定 38 实验六 连接转化子的鉴定与大量提取 38 实验七 大肠杆菌BL21（DE3）的转化和转化子酶活鉴定 39 第四部分 环境工程综合实验 实验一 接触氧化法处理有机废水实验 40 实验二 SBR法处理有机废水实验 42 第一部分 啤酒工艺综合实验 实验一 还原糖的测定 1原理 本法是利用含有自由醛基的还原糖，在碱性溶液中，能将二价铜还原成氧化亚铜的性质进行测定。 2仪器 下端弯曲与管身成直角的滴定管。 3试剂 （1） 0.1N 硫代硫酸钠标准溶液 配制：溶26克硫代硫酸钠及0.2克无水碳酸钠于1000ml水中。缓和煮沸10min，冷却。将溶液保存于棕色具塞瓶中，放置一周后过滤备用。 标定： 称取于120℃烘至恒重的重铬酸钾0.2克，称准至0.0002克，置于500ml具塞锥形瓶中，溶于25ml煮沸并冷却的水中，加2克碘化钾及20ml 4N的硫酸。待碘化钾溶解后，于暗处放置10min，加250ml水，用 0.1 N硫代硫酸钠溶液滴定，近终点时加3ml 0.5%淀粉指示剂，继续滴定至溶液由蓝色转变成亮蓝绿色。同时作空白试验校正结果。硫代硫酸钠标准溶液当量浓度N按下式计算： N= G/0.04903V 式中： G—— 重铬酸钾的重量（克） V—— 硫代硫酸钠溶液的用量（ml） 0.04903—— 每毫克当量重铬酸钾的克数 （2） 4N的硫酸溶液 边搅拌边将56ml的浓硫酸小心地加入到约350ml蒸馏水中，并定容至500ml。 （3） 0.5%淀粉溶液 1.25g可溶性淀粉，加少量水调成糊状，在不断搅拌下注入200ml沸水中，微沸2min，冷却，加水稀释成250ml。 （4）30%醋酸溶液 取29.8ml无水乙酸，用水定容至100ml. （5） 斐林溶液 A. 硫酸铜溶液 溶34.639克硫酸铜于水中，稀释至500.0ml。 B. 碱性酒石酸盐溶液 溶173克酒石酸钾钠，50克氢氧化钠溶于水中，稀释至500.0ml。 4标定： 取10.00ml斐林溶液的A液，加4ml30%醋酸溶液和3g碘化钾，加25ml煮沸后冷却的水，使碘化钾溶解，以0.1N 硫代硫酸钠标准溶液滴定溶液呈微黄色，加硫氰酸铵2g，0.5%淀粉溶液3ml，搅拌后，继续滴定至蓝色消失。斐林溶液的校正系数f计算如下： 式中： V——0.1N 硫代硫酸钠标准溶液的用量（ml） 0.006355—— 每毫升0.1N 硫代硫酸钠溶液相当的铜的克数 0.01748—— 每毫升斐林溶液的A液中含有的铜的克数 （6）次甲基蓝指示液，1% 1g次甲基蓝溶于100ml水中。 5操作步骤 （1）取糖化试验的麦芽汁，稀释至20倍或更合适的倍数，使其滴定量在15～50ml之间。 （2） 预备实验 取斐林溶液A、B各5.0ml，置锥形瓶中，加10ml水稀释，加热使其于5min内沸腾，在沸腾状态下用滴定管滴入稀释麦芽汁至蓝色即将消失时，加1～2滴次甲基蓝指示液，继续滴定至蓝色消失，记录所用稀释麦芽汁的数量。 （3） 正式测定 在200ml锥形瓶中加入斐林溶液A、B各5.0ml，再加少于预备实验所用1ml的麦芽汁，加热至沸后，加1～2滴次甲基蓝指示液，用稀释麦芽汁滴至终点，记录用去稀释麦芽汁的总量。 6计算 根据稀释麦芽汁在正式测定中的用量，查表得相应麦芽糖量，再用下式计算： 查表得100ml麦芽汁中麦芽糖毫克数 1000 总还原糖（麦芽糖，g/ml麦汁）＝f×n 或 f×查表得100ml麦芽汁中麦芽糖毫克数×n 1000×G×D 总还原糖（麦芽糖，g/100g浸出物）＝ 式中： f——斐林溶液系数 n—— 稀释倍数 G—— 麦芽汁中浸出物含量（%） D——麦芽汁20℃比重 注意事项： （1） 本测定的操作条件必须严格控制，加热时间、滴定速度每次测定都必须一致，由沸腾至滴定完毕必须在3min内结束，否则应重做。 （2） 用硫代硫酸钠标准溶液标定斐林溶液，标准溶液的浓度应正好0.1000N，否则计算时应把用量换算成相当于0.1000N的用量。 实验二 α-氨基氮的测定（茚三酮法） 1、实验试剂 a显色剂 100克磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O） 60克磷酸二氢钾（KH2PO4） 5.00克水合茚三酮 3.00克果糖 用水溶液溶解后稀释至1升（此溶液在低温下用棕色瓶可保存2周，pH应为6.6-6.8。操作时可以按比例配成100ml）。 b稀释溶液：2克碘酸钾溶于600ml水中，再加入96%乙醇400ml. c标准溶液：溶107.2mg甘氨酸于100ml水中，0℃贮藏。用时按要求稀释。该溶液含有200mgα-氨基氮/升。 2、实验操作 取糖化的麦芽汁1.00ml（或者是其他的合适量，使稀释后的浓度为1-3mgα-氨基氮/升），放入100ml的容量瓶中，稀释到刻度，摇匀。 标准甘氨酸溶液稀释液：取1.00ml标准溶液，在100ml的容量瓶中稀释到刻度。 取麦芽汁稀释溶液、水、标准的甘氨酸溶液（三个）稀释液各2.00ml，放入比色管中，（水用于空白对照），各比色管中分别加入1.00ml的显色剂，摇匀，在沸水中加热16min。（此时应该准备20℃的水浴） 20℃水浴中冷却20min。 加入5.00ml的碘酸钾稀释溶液，摇匀，在30min内于570nm处测定吸光度值。 3、计算 游离的α-氨基氮（毫克/升麦芽汁）=2×100×样品溶液吸光度值 / 标准溶液平均吸光度 实验三 双乙酰（紫外分光光度法） 1原理 双乙酰作为挥发性组份从啤酒样中蒸发出来，与邻苯二胺反应，生成2，3－二甲喹喔啉，在335nm波长下进行测定。由于其他联二酮类都具有相同的反应特性，再加上蒸馏过程中部分前驱体要转化成联二酮，因此上述测定结果为总联二酮含量(以双乙酰表示)。 2 仪器 a) 带有加热套管的双乙酰蒸馏器 ； b) 具有锥形瓶(或平底蒸馏烧瓶)的蒸汽发生瓶：2000mL(或3000mL) ； c) 容量瓶：25 mL ； d) 紫外分光光度计：备有10mm石英比色皿或20mm玻璃比色皿。 3 试剂和溶液 a) 4mol/L盐酸溶液：按GB/T 601配制； b) l0g/L邻苯二胺溶液：称取邻苯二胺0.100g，溶于4mol/L盐酸溶液中，并定容至10mL，摇匀，放于暗处。此溶液须当天配制与使用；若配制出来的溶液呈红色，应重新更换新试剂； c) 有机硅消泡剂(或甘油聚醚) 。 4 分析步骤 4.1 蒸馏 将双乙酰蒸馏器安装好，加热蒸汽发生瓶，使水至沸。通汽预热后，置25mL容量瓶于冷凝器出口接受馏出液，外加冰浴冷却，加2～4滴消泡剂于100mL量筒中，再注入未经除气的预先冷至5℃左右的酒样100mL，迅速移入已预热的蒸馏器内，并用少量水冲洗带塞漏斗，盖塞。然后用水封口，进行蒸馏，直至馏出液接近25mL(蒸馏需在3～5min内完成)时取下容量瓶，达到室温用水定容，摇匀。 4.2 显色与测量： 分别吸取馏出液10.0mL于两支干燥的比色管中，并于第一支管中加入邻苯二胺溶液0.50mL，第二支管中不加(做空白)，充分摇匀后，同时置于暗处放置20～30min，然后于第一支管中加4mol/L盐酸溶液2mL，于第二支管中加入4mol/L盐酸溶液2.5mL，混匀后，于335nm波长下，用20mm玻璃比色皿，以空白调仪器零点，测定其吸光度。比色测定操作须在20min内完成。 5分析结果的表述 试样中双乙酰含量按式(2)计算： ……………………………………………………………(2) 式中： X —— 试样中双乙酰的含量，mg/L ； A335 —— 试样在335nm波长下，用20mm比色皿测得的吸光度； 1.2—— 吸光度与双乙酰含量的换算系数。 实验四 总酸（电位滴定法） 1 原理 酸碱中和原理。用氢氧化钠标准溶液直接滴定啤酒试样中的总酸，以pH=8.2为电位滴定的指示终点，根据消耗氢氧化钠标准溶液的体积计算出啤酒试样中总酸的含量。 2 仪器 自动电位滴定仪：精度±0.02pH，附电磁搅拌器 ； 恒温水浴：精度±0.5℃，带振荡装置。 3 试剂和溶液 a) 0.1mol/L氢氧化钠溶液：按GB/T 601 配制与标定。 b) 标准缓冲溶液：现用现配。 4 分析步骤 4.1 试样的处理：取试样（5.1）约60mL于100mL烧杯中，置于(40±0.5)℃振荡水浴中恒温30min，取出，冷却至室温。 4.2 测定： a) 按使用说明书安装与调试仪器。 b) 用标准缓冲溶液校正自动电位滴定仪。用水清洗电极，并用滤纸吸干附着电极的液珠。 c) 吸取处理好的试样50.0mL于烧杯中，放入校正好的电极，开启电磁搅拌器，用氢氧化钠标准溶液滴定，开始每次约加1.0mL直至pH=7.6，然后每次滴加0.10mL直至pH=8.2为其终点 ，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。 5结果 试样的总酸按式(3)计算： ……………………………………………………(3) 式中： X —— 试样的总酸，即100mL试样消耗氢氧化钠标准溶液[c(NaOH)=0.1mo1/L] 毫升数，mL/100mL： c —— 氢氧化钠标准溶液的浓度，mo1／L V —— 消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL； 2 —— 换算成100mL试样的系数。 所得结果应表示至一位小数。 6 允许差 同一试样两次测定值之差，不得超过平均值的4％。 实验五 酒精度 1 原理 利用在20℃时酒精水溶液与同体积纯水质量之比，求得相对密度(以d2020表示)。然后，查表得出试样中酒精含量的百分比，即酒精度，以%(V/V）或％(m/m)表示。 2 仪器 a) 全玻璃蒸馏器：500mL； b) 恒温水浴：精度±0.1℃； c) 容量瓶：100mL ； d) 移液管：100 mL ； e) 分析天平，感量0.1mg ； f) 天平：感量0.1g ； g) 附温度计密度瓶：25mL或50mL； h) 数字密度计和注射器。 3 分析步骤 3.1 容量法 3.1.1蒸馏 用100mL容量瓶准确量取试样（5.1）100mL，置于蒸馏瓶中，用50mL水分三次冲洗容量瓶洗液并入蒸馏瓶中，加玻璃珠数粒，装上蛇型冷凝管，用原100mL容量瓶接收馏出液(外加冰浴)，缓缓加热蒸馏(冷凝管出口水温不得超过20℃)，收集约96mL馏出液(蒸馏应在30～60min内完成)，取下容量瓶，调节液温至20℃，补加水定容，混匀，备用。 a)测量A 将密度瓶洗净、干燥、称量，反复操作，直至恒重。 将煮沸冷却至15℃的水注满恒重的密度瓶，插上带温度计的瓶塞(瓶中应无气泡)，立即浸于(20±0.1)℃的恒温水浴中，待内容物温度达20℃，并保持5min不变后取出。用滤纸吸去溢出支管的水，立即盖好小帽，擦干后，称量。 b)测量B 将水倒去，用馏出液a)反复冲洗密度瓶三次，然后装满，按b)同样操作。 试样馏出液(20℃)的相对密度按式(4)计算： ………………………………………………………………(4) 式中： d2020 —— 试样馏出液(20℃)的相对密度(比重)； m2 —— 密度瓶和馏出液的质量，g ； m —— 密度瓶的质量，g ； m1 —— 密度瓶和水的质量，g 。 根据相对密度查附录A，得到馏出液的酒精度，%(V/V)或g/100mL。 即为啤酒试样的酒精度，%(V/V) 或g/100mL。所得结果应表示至两位小数。 3.2 重量法 a) 蒸馏 称取制备好的试样(5.1) 100g，精确至0.1g，全部移入500mL已知质量的蒸馏瓶中，加水50mL和数粒玻璃珠，装上蛇型冷凝器(或冷却部分的长度不短于400mm的直型冷凝器)，开启冷却水，用已知质量的100mL容量瓶接收馏出液(外加冰浴)，缓缓加热蒸馏(冷凝管出口水温不得超过20℃)，收集约96mL馏出液(蒸馏应在30～60min内完成)，取下容量瓶，调液温至20℃，然后补加水，使馏出液质量为100 .0g(此时总质量为100.0g十容量瓶质量)，混匀。(注意保存蒸馏后的残液，供做真正浓度用)。 b) 测量A和 测量B c) 计算试样馏出液(20℃)相对密度。根据相对密度查附录A，得到馏出液的酒精度，%(m/m)。即为啤酒试样的酒精度，%(m/m) 。所得结果应表示至两位小数。 4 允许差 同一试样两次测定值之差不得超过平均值的1％。 实验六 原麦汁浓度（蒸馏——密度法） 1 原理 以蒸馏——密度法测出啤酒试样中的真正浓度和酒精度。按经验公式计算出啤酒试样的原麦汁浓度。或用仪器法直接自动测定、计算、打印出样品的真正浓度及原麦汁浓度。 2仪器 同实验。 3分析步骤 3.1 真正浓度的测定。 a) 试样的制备：将重量法(在已知重量的蒸馏烧瓶中)蒸馏除去酒精后的残液，冷却至20℃，准确补加水使残液至100.0g，混匀。 或用已知质量的蒸发皿称取试样100.0g，精确至0.1g，于沸水浴上蒸发， 直至原体积的1/3，取下冷却，加水恢复至原质量，混匀。 b) 试样的测定：用密度瓶或密度计测定出残液的相对密度。查附录B中的表B1，求得100g啤酒试样中浸出物的克数(g/100g)。即为啤酒的真正浓度，以plato度(°P) 或 %(m/m)表示。 3.2 酒精度同9.1.4 。 4结果 根据测得的酒精度和真正浓度，按式(5)计算出原麦汁浓度： ……………………………………………(5) 式中：X —— 原麦汁浓度，°P [％(m/m)]； A —— 酒精度，％(m/m)； E —— 真正浓度，°P [％(m/m)] 。 或查附录B中的表B2，原麦汁浓度按式(6)计算： ……………………………………………(6) 式中：X —— 原麦汁浓度，°P [％(m/m)]； A —— 酒精度，％(m/m)； E —— 真正浓度，°P [％(m/m)]； b —— 校正系数。 所得结果表示至一位小数。 实验七 真正发酵度(实际发酵度) 啤酒的真正发酵度(RDF)按式(7)或(8)计算： ………………………………………(7) 式中： RDF —— 啤酒的真正发酵度，% ； A —— 啤酒的酒精度，%（m/m）； ER —— 啤酒的真正浓度，°P [ %(m/m)] 。 ……………………………………(8) 式中： RDF —— 啤酒的真正发酵度，% ； Y —— 啤酒的原麦汁浓度，°P [ %(m/m)] ； Z —— 啤酒的真正浓度，°P [ %(m/m)] ； 0.005161——换算系数。 实验八 协定法糖化和外加酶糖化法 1实验目的： a) 协定糖化法的实验方法； b) 研究糖化工艺条件对麦汁组分影响； c) 了解a-氨基氮的测定方法及其对麦汁的影响 d) 高辅料比时外加酶糖化法的研究 2要求和实验步骤 2.1协定麦汁的制备步骤： A) 取50克麦芽，在ＥＢＣ标准磨上粉碎； B) 将已经粉碎好的麦芽粉放入已称重的糖化杯中，加200ml毫升46℃水，于不断搅拌下在46℃水浴中保温30分钟； C) 使醪液以每分钟升温1℃的速度，加热水浴，升温至70℃。此时杯内加入100ml 70℃水，保持恒温； D) 5分钟后，用玻棒取麦芽汁1滴，置于白滴板上，再加碘液1滴 ，混合，观察碘液颜色。直至碘液呈纯黄色，不变色，糖化结束； E) 在10~15分钟内急速冷却到室温； F) 冲洗搅拌器，擦干糖化杯外壁，加水使其内容物准确称量为450克； G) 用玻棒搅动糖化杯，并注于漏斗中进行过滤； H) 收集约100 ml滤液后，将滤液返回重滤。过30分钟，用玻棒稍稍搅动麦糟层。收集整个滤液于一干烧杯中。 2.2外加酶糖化法 根据麦芽的指标，酿造40%辅料比的麦汁，要求麦汁的a-氨基氮符合要求。 3实验室提供条件 大米、二级麦芽，高温淀粉酶，啤酒酿造复合酶，细菌中性蛋白酶。 第二部分 通风发酵综合实验 实验一 淀粉质原料的水分测定 水分在工业发酵中是一个极为重要的分析项目。原料中水分，对原料的品质与保存关系甚大。水分过高，原料在贮藏时容易发霉变质，影响原料的利用价值。 水分测定方法一般采用烘干法，即在100-105℃烘箱中直接干燥。 1 原理 样品中的水分受热后产生的蒸汽压，高于空气在电热干燥箱中的分压，水分便从样品中挥发出来。样品干燥的速度取决于这个压差的大小，在此条件下失去的主要是试样中的游离水。试样的水分一般是指在100℃左右直接干燥的情况下，所失去的总量。在此条件下失去的重量不仅是水分，还有微量的挥发性物质。 2 仪器与设备 （1）分析天平 （2）称量瓶 （3）干燥器 （4）电热恒温干燥箱 3 测定步骤 准确称取约2克试样，置入经100-l05℃干燥恒重后的称量瓶中，在100-105℃烘箱中干燥3-4小时，取出，置入干燥器中冷却至室温，称重。再于相同温度下干燥1小时左右，同上操作，直至恒重。 计算 式中 W0：称量瓶重（g） W1：干燥前试样与称量瓶重（g） W2：干燥后试样与称量瓶重（g） 4 说明 （1）原料的水分测定一般需采用100-105℃烘箱中直接干燥，其结果较为准确。对生产过程中的水分快速测定，可采用更高温度下干燥(如120-140℃)或红外灯下干燥，以缩短分析时间。 （2）测定水分时，称量恒重指试样连续两次干燥后，称量之差不超过2mg。 5 参考书 （1）天津轻工业学院等，《工业发酵分析》，轻工业出版社，1980年 实验二 原料中粗淀粉的测定 1 原理 淀粉经酸或水解生成葡萄糖： 所生成的葡萄糖用斐林试剂测定。 斐林试剂由甲、乙液组成。甲液为硫酸铜溶液，乙液为氢氧化钠与酒石酸钾钠溶液。平时甲、乙液分别贮存，测定时甲、乙液等体积混合。混合时，硫酸铜与氢氧化钠反应，生成氢氧化铜沉淀： 2NaOH+CuSO4=Cu(OH)2↓+Na2SO4 所生成的氢氧化铜沉淀与酒石酸钾钠反应，生成酒石酸钾钠铜络合物，使氢氧化铜溶解： 酒石酸钾纳铜络合物中二价铜是一个氧化剂，能使还原糖中羰基氧化，而二价铜被还原生成一价的氧化亚铜沉淀： 反应终点用次甲基蓝指示剂显示。因次甲基蓝氧化能力较二价铜弱，故待二价铜全部被还原后，过量一滴还原糖立即使次甲基蓝还原，溶液蓝色消失以示终点： 2 试剂 2.1 斐林试剂 甲液：称取69.3克硫酸铜(CuSO4·15H2O)，用水溶解并稀释至1000毫升，如有不溶物可用滤纸过滤。 乙液：称取346克酒石酸钾钠，100克氢氧化钠，用水溶解并稀释至1000毫升。 2.2 2％盐酸溶液 量取4.5毫升浓盐酸，用95.5毫升水稀释。 2.3 20％盐酸溶液 量取20毫升浓盐酸，缓慢倒入80毫开水中。 2.4 20％氢氧化钠溶液 称取200克氢氧化钠，用水溶解并稀释至1000毫升。 2.5 1％次甲基蓝溶液 称取1克次甲基蓝，加100毫升水，加热溶解，贮存于棕色瓶中。 2.6 0.2％标准葡萄糖溶液 准确称取2克无水葡萄糖(预先于100~l05℃烘干)，用水溶解，加5毫升浓盐酸，用水定容至1000毫升。 3 仪器与设备 （1）三角瓶 （2）长玻璃管(约1米) （3）容量瓶 （4）分析天平 （5）干燥器 （6）电热恒温干燥箱 （7）滴定管 （8）称量瓶 （9）移液管 （10）pH试纸试验 （11）电炉 （12）小铜锅 4 测定步骤 4.1 试样水解 粗淀粉测定中试样水解：准确称取试样1.5~2克，置入250毫升三角瓶中。加l00毫升2%盐酸溶液，轻轻摇动三角瓶，使试样充分湿润。瓶口按上回流冷凝器或长玻璃管(约1米)，于沸水浴中回流水解3小时(图2-1)。取出，迅速冷却，用20％氢氧化钠溶液中和至中性或微酸性(用pH试纸试验)。滤纸过滤滤液用500毫升容量瓶接收，用水充分洗搽残渣，然后用水定容至刻度，摇匀，为供试糖液。 4.2 斐林试剂的校正 吸取斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，加20毫升水，并从滴定管中加入约24毫升0.2％标准葡萄糖溶液(其量应控制在后滴定时消耗0.2％标准葡萄糖溶液在1毫升以内)，摇匀，于电炉上加热至沸，并保持微沸2分钟。加2滴1％次甲基蓝溶液继续用0.22％标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作需在1分钟内完成。总耗糖量为v毫升。 图2-1 水解装置 校正值的计算： 先求得10毫升斐林试剂相当的葡萄糖克数(F)， F=CV 式中 C：标准葡萄糖溶液浓度(g/ml) 再从斐林试剂糖量表(见附表2-1)查得V毫升时相当的葡萄糖克数(F0)，斐林试剂校正值f为： 4.3 定糖 吸取斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，加20毫升水，并从滴定管中预先加入适量的水解糖液(其量应控制在后滴定时消耗水解糖液在1毫升以内)，摇匀，于电炉上加热至沸，并保持微沸2分钟。加2滴1％次甲基蓝溶液，继续用水解糖液滴定至蓝色消失，此滴定操作需在1分钟内完成。 5 计算 从附表2-1查得10毫升斐林试剂消耗水解糖液体积相当于100毫升水解糖液中所含葡萄糖量（G），则1毫升水解糖液中含葡萄糖量为G/100，再乘以斐林试剂校正值，即为1毫升水解糖液中实际含葡萄糖量： 式中 500：试样稀释体积（ml） W：试样重量（g） 0.9：葡萄糖与淀粉的换算系数 6 参考书 （1）天津轻工业学院等，《工业发酵分析》，轻工业出版社，1980年 附表2-1 斐林试剂糖量表 消耗糖液 体 积 (毫升) 相当葡萄 糖 量 (毫克) 100毫升糖液中所含葡萄糖的量 (毫克) 消耗糖液 体 积 (毫升) 相当葡萄 糖 量 (毫克) 100毫升糖液中所含葡萄糖的量 (毫克) 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 49.1 49.2 49.3 49.3 49.4 49.5 49.5 49.6 49.7 49.8 49.8 49.9 49.9 50.0 50.0 50.1 50.2 50.2 327 307 289 274 260 247.4 235.8 225.5 216.1 207.4 199.3 191.8 184.9 178.5 172.5 167.0 161.8 156.9 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 50.3 50.3 50.4 50.4 50.5 50.5 50.6 50.6 50.7 50.7 50.7 50.8 50.9 50.9 51.0 51.0 51.0 51.1 152.4 148.0 143.9 140.0 136.4 132.9 129.6 126.5 123.6 120.8 118.1 115.5 113.0 110.6 108.4 106.2 104.1 102.2 实验三 还原糖的测定 1 原理 原糖的测定采用快速法。其反应与粗淀粉测定相似，不同点为斐林试剂甲液中硫酸铜量较小，适用于含糖量较少的试样。另外，斐林试剂中加入亚铁氰化钾(黄血盐)，使红色氧化亚铜沉淀生成可溶性的复盐，反应终点更为明显。 Cu2O+K4Fe(CN)6+H2O=K2Cu2Fe(CN)6+2KOH (淡黄色) 2 试剂 2.1 斐林试剂 甲液：称取35g硫酸铜，0.05g次甲基蓝，用水溶解并定容至1000ml。 乙液：称取117g酒石酸钾钠，126.4g氢氧化钠，9.4g亚铁氰化钾，用水溶解并定容至1000ml。 2.2 0.1%标准葡萄糖溶液 精密称取1.0000g经95~105℃烘干的无水葡萄糖，用少量水溶解，加入5ml盐酸，用蒸馏水定容至1000ml，摇匀。 3 仪器与设备 （1）三角瓶 （2）容量瓶 （3）分析天平 （4）干燥器 （5）电热恒温干燥箱 （6）滴定管 （7）称量瓶 （8）移液管 （9）电炉 4 测定步骤 4.1 斐林试剂的标定 吸取斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，加10毫升水，并从滴定管中预先加入约20毫升0.1%标准葡萄糖溶液(其量控制在后滴定时消耗0.1%标准葡萄搪溶液1毫升以内)，摇匀，于电炉上加热至沸，立即以4~5秒钟1滴的速度继续用0.1%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作需在1分钟内完成，总耗糖量为V0毫升。 4.2 定糖 预备试验：吸取斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，加入V1毫升试样稀释液(含葡萄糖量约为5~15毫克)及适量的0.1%标准葡萄糖溶液，摇匀，以下同标定时操作，总耗糖量为V2毫升。 正式试验：吸取斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，加V1毫升试样稀释液和(V2-1)毫升0.1%标准葡萄糖溶液，补加[(V0+10)-(V1+V2)]毫升水，摇匀，以下同标定时操作，总耗糖量为V毫升。 重复测定两次，取总消耗标准葡萄糖液体积的平均值V ml。 5 计算 式中 V0：斐林试剂标定值(毫升) V：斐林试剂测定值(毫升) C：标准葡萄糖溶液浓度(克/毫升) n：试样稀释倍数 v1：所取试样稀释液体积(毫升) 6 说明 (1)滴定速度、三角瓶壁厚度和热源的稳定程度等，对测定精密度影响很大。平行测定的滴定毫升数相差不应超过0.1ml，故在标定、预备、正式测定过程中，实验条件应力求一致。 (2)滴定过程应该始终保持在微沸状态下进行。沸腾后继续滴定至终点的毫升数应控制在0.5~lml内，否则应重新测定。 (3)样品液中还原糖浓度不宜过高或过低，根据预备试验结果，应将样品液稀释至还原糖的含量在1%左右为宜。 (4)滴定至终点蓝色褪去之后，就不应再滴定，因四甲基蓝指示剂被还原褪色后，当接触空气时，又会被氧化重现篮色。 (5)斐林溶液与还原糖之间的反应因受溶液碱性、加热湿度和时间以及副反应等影响，而没有严格的定量关系，不能由当量定律来求出试样中还原糖的含量，只熊根据在相同实验条件下消耗相应的标准还原糖量或由严格相同的实验条件下得出的还原糖检索表上查得相应的还原糖量来进行计算。所以用廉-爱农法定糖时，必须先用相应的标准还原糖标定斐林溶液。 7 参考书 （1）天津轻工业学院等，《工业发酵分析》，轻工业出版社，1980年 实验四 蛋白酶活力的测定方法 1 原理 根据福林试剂(磷钼酸与磷钨酸混合物)，在碱性情况下极不稳定，可被酞类化合物还原而呈蓝色反应(钼蓝和钨蓝的混合物)，由于蛋白质分子中含有酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸及苯丙氦酸等)，它使蛋白质或其水解产物也呈这个反应，于是就可利用这个原理来测定蛋白酶活力的强弱，即以酪蛋白为作用底物，在一定pH与温度下，同酶液反应，经一定时间后，加入三氯醋酸，以终止酶反应，并使残余的酪蛋白质沉淀，同水解产物分开，经过滤后取滤液(即含蛋白水解产物的三氯醋酸液)。用碳酸钠碱化，再加入福林试剂使之发色，用分光光度计或光电比色计测定。蓝色反应的强弱，同三氯醋酸中蛋白水解产物的多少成正比而水解产物的量又是同酶活力成正比例关系。因此，根据蓝色反应的强弱就可推测蛋白酶的活力。 2 试剂 2.1 福林试剂 于2000ml磨口回流装置内加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g，钨酸钠(NaMoO4·2H2O)25g，水700ml，85%磷酸50m1，浓盐酸1000ml，文火回流10h．加入硫酸锂(Li2SO4)150g，蒸溜水50m1，混匀取去冷凝器，加入几滴液体溴，再煮沸l5min，以驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色，需再滴加溴液。再煮沸除去之。冷却后，定溶至1000ml。细菌漏斗4~5号过滤，置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释，即成稀释的福林试剂。 2.2 0.4mol/L三氯醋酸(TCA)溶液 称取三氯醋酸65.4g，定容至1000ml。 2.3 0.4mol/L碳酸钠溶液 称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g，定容至1000m1。 2.4 0.05mol/L pH2.5 乳酸-乳酸钠缓冲液 A液：称取10.6g80-90%乳酸加蒸馏水定容至1000ml。 B液：称取16克70%乳酸钠加蒸馏水定容至1000ml。 取A液16ml与B液1ml稀释1倍即成0.05mol/L pH2.5 乳酸-乳酸钠缓冲液。 2.5 2%酪蛋白溶液 称取干酪素2g加入0.1mol/L氢氧化钠20ml在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸)，然后用pH2.5乳酸-乳酸钠缓冲液定容至1000mI即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存。否则极易繁殖细菌，引起变质。 配制酪蛋白溶液定容时，若泡沫过多，则可加1~2滴酒精消泡。3350酸性蛋白酶酪蛋白溶液的配制，应加弄乳酸2~3滴湿润。 2.6 100μg/m1酪氨酸溶液 精确称取在l05℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1g，逐步加入0.1mol/L盐酸(HCl)使溶解，加蒸溜水定容至100m1，其浓度为1000μg/m1。再吸取此液10ml以蒸馏水定容至100ml即配成100μg/m1酪氨酸镕液．此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存，以免繁殖细菌而变质。 3 操作步骤 3.1 标准曲线的绘制 （1）按表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液 试剂（ml） 管 号 1 2 3 4 5 6 蒸馏水 10 8 6 4 2 0 100μg/m1酪氨酸 0 2 4 6 8 10 酪氨酸最终浓度（μg/m1） 0 20 40 60 80 100 (2)测定步骤 另取6支试管按上表编号分别吸取不同浓度的酪氨酸1ml，各加入0.4mo1/L碳酸钠5m1，再加入已稀释的福林试剂1m1。摇匀置于水浴锅中，40℃保温发色20min，在于波长660nm处测定吸光度。一般测3次，取平均值． 以吸光度为纵座标。酪氨酸的浓度为横座标，绘制成标准曲线。 3.2 酶液的制备 准确称取蛋白酶固态发酵的湿曲2g，用10~20ml蒸馏水，30℃浸提半小时，用滤纸过滤。将滤液稀释一定倍数(使其测定光密度在0.2~0.4范围内为宜)。 3.3 测定 取四支试管，分别加入1ml稀释酶液，其中一支为空白管，三支为平行试验管。置入40℃水浴中预热3~5min，在三支平行试验管中分别加入1ml2%酪蛋白溶液，准确计时保温10min。立即加入2ml 0.4M三氯乙酸溶液，l5min后用滤纸过滤。分别吸取1ml清液，加5ml0.4M碳酸钠溶液，最后加入1ml福林-酚试剂，摇匀，于40℃水浴中显色20min。 空白管中先加入2ml0.4M三氯乙酸溶液，再加lml2%酪蛋白溶液，15min后用滤纸过滤。以下操作与平行试验管相同。 见空白管为对照，在680纳米波长下测光密度，取其平均值。 4 计算 蛋白酶活力单位定义：在40℃，pH2.5下，每分钟水解酪蛋白释放1微克酪氨酸的酶量定义为1个蛋白酶单位。