从糖原合成酶激酶-3β干预...对糖尿病溃疡大鼠的促愈机制_袁璐.pdf

中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 826 从糖原合成酶激酶-3干预炎症反应角度探讨四妙勇安汤对糖尿病溃疡大鼠的促愈机制袁璐1，魏建梁2，赵亚男1,2，王冠2，张玥2，张玉冬2，郝清智2，孙磊3（指导：刘明2）（1山东中医药大学，济南 250014；2山东中医药大学附属医院，济南 250014；3山东中医药大学第二附属医院，济南 250000）摘要：目的：观察四妙勇安汤对糖尿病溃疡大鼠巨噬细胞浸润状态、糖原合成酶激酶-3（GSK-3）及炎症因子白介素（IL）-6、IL-10表达的影响。方法：雄性Wistar大鼠采用高脂高糖饲料联合小剂量链脲佐菌素液腹腔注射法制备糖尿病模型。分别取正常对照组与糖尿病组制作溃疡模型，并分为对照组、模型组、四妙组、氯化锂组，每组20只。四妙组给予四妙勇安汤水煎液灌胃，氯化锂组给予氯化锂水溶液灌胃，余给予0.9%氯化钠溶液灌胃。观察创面造模后第3、7、14、21天各组创面愈合情况的变化，并采用CD68免疫组化染色法检测创面巨噬细胞浸润状态的变化，采用ELISA法、Q-PCR法检测创面组织中GSK-3、IL-6、IL-10蛋白及mRNA的变化。结果：模型组大鼠创面巨噬细胞较对照组大鼠呈现慢进慢出的状态，而四妙组改善了巨噬细胞的浸润状态。与对照组比较，模型组、四妙组、氯化锂组大鼠的创面愈合率显著降低（P0.05），GSK-3、IL-6蛋白及mRNA水平显著升高（P0.05），IL-10水平显著降低（P0.05）。与模型组比较，四妙组大鼠的创面愈合率及GSK-3、IL-6、IL-10水平均得到显著改善（P0.05），同时，四妙组对GSK-3的影响弱于氯化锂组，对IL-10水平的影响优于氯化锂组。另外，四妙组使IL-6的高峰时间前移。结论：GSK-3可通过影响创面巨噬细胞浸润状态及炎症因子的水平而延缓糖尿病溃疡大鼠的创面愈合，而四妙勇安汤通过改善GSK-3及炎症反应达到促进愈合的目的。关键词：糖尿病溃疡；四妙勇安汤；糖原合成酶激酶-3；炎症反应；促愈机制；脱疽基金资助：国家自然科学基金项目（No.82004369），中国博士后科学基金（No.2022M711986），山东省自然科学基金项目（No.ZR2017MH038）Promoting healing mechanism of Simiao Yongan Decoction in diabetic ulcer rats from the perspective of glycogen synthase kinase-3 intervention in inflammatory responseYUAN Lu1,WEI Jian-liang2,ZHAO Ya-nan1,2,WANG Guan2,ZHANG Yue2,ZHANG Yu-dong2,HAO Qing-zhi2,SUN Lei3(Advisor:LIU Ming2)(1Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250014,China;2The Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250014,China;3The Second Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250000,China)Abstract:Objective:To observe the effects of the Simiao Yongan Decoction on the state of macrophage infiltration,the level of glycogen synthase kinase-3(GSK-3),interleukin(IL)-6 and IL-10 in diabetic ulcer rats.Mehtods:Diabetic models were established in the male Wistar rats by intraperitoneal injection of low-dose Streptozotocin following high-fat diet feeding.A circular wound was made on the dorsum of the rats in both control group and diabetic group.And then,the ulcer rats were divided into 4 groups:the control ulcer group,the model group,the Simiao group,and LiCl group,20 rats in each group.The rats in Simiao group were given Simiao Yongan Decoction by intragastric administration,while the rats in LiCl group were given LiCl solution,and others were given 0.9%sodium chloride solution.The condition of wound healing was recorded and the state 研究报告通信作者：赵亚男，山东省济南市经十路16369号山东中医药大学附属医院，邮编：250014，电话：0531-68616034E-mail：内文2.indd 8262023/2/28 10:36:20中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 827 糖尿病溃疡是糖尿病的严重并发症之一，具有迁延难愈、易感染、易导致截肢或脓毒症的特点1。据统计，2016年，全球糖尿病相关下肢并发症患者约有1.31亿人，其中250万患者因足部溃疡导致残疾而缩短生命2。资料显示，每年超过100万患者因糖尿病足溃疡而导致不同程度的截肢3。糖尿病溃疡隶属于中医学“脱疽”病的范畴，四妙勇安汤首见于华佗神医秘传，是古籍中最早记载治疗“脱疽”病的专方。四妙勇安汤广泛应用于临床糖尿病溃疡的治疗，疗效显著4。为研究四妙勇安汤对糖尿病溃疡的促愈机制，本实验以糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）干预炎症反应为切入点，建立糖尿病溃疡大鼠模型，并给予四妙勇安汤干预，以探讨四妙勇安汤对糖尿病溃疡创面GSK-3-炎症反应的调节作用。材料1.动物 清洁级Wistar大鼠100只，雄性，8周龄，体质量180200 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号：SCXK（鲁）20140007。2.药物与试剂 四妙勇安汤水煎剂组成：金银花90 g，玄参90 g，当归60 g，甘草30 g，饮片购自山东中医药大学附属医院，汤液经过悬蒸仪浓缩至5.625 g/mL。高脂高糖饲料（59%基础饲料+20%蔗糖+18%猪油+3%蛋黄）由济南朋悦实验动物繁育有限公司加工制作；链脲佐菌素（streptozocin，STZ）（北京索莱宝科技有限公司，货号：S8050），无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司，货号：1009218），异丙醇（国药集团化学试剂有限公司，货号：40064360），Trizol总RNA提取试剂（上海碧云天生物技术有限公司，货号：R0016），无霉无菌水DNase/RNase-Free Water（上海碧云天生物技术有限公司，货号：R0021），SYBR Green（美国Invitrogen公司，货号：S7567），mRNA逆转录试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司，货号：P611-01），大鼠白介素（interleukin，IL）-6 ELISA试剂盒（杭州联科生物股份有限公司，货号：70-EK306），大鼠IL-10 ELISA试剂盒（杭州联科生物股份有限公司，货号：70-EK310），大鼠GSK-3 ELISA试剂盒（R&D公司，货号：CK-E332807R），氯仿（北京索莱宝科技有限公司，货号：P1011）、柠檬酸（北京索莱宝科技有限公司，货号：C8610）、柠檬酸三钠（北京索莱宝科技有限公司，货号：S8220）、氯化锂（北京索莱宝科技有限公司，货号：C8380），CD68免疫染色通用SP试剂盒（北京中杉金桥公司，货号：bs-20402R）。3.仪器 352型酶标仪（Labsystems Multiskan MS），TG16-W型微量高速离心机（湖南湘仪离心机有限公司），罗康全活力型罗氏血糖仪（罗氏诊断产品有限公司），T1型高速低温离心机（Sorvall Super），ND1000型紫外分光光度计（Nanodrop），T-Gradient型梯度PCR扩增仪（Biometra），Alpha ImagerTM 2200型凝胶成像系统（Alpha Innotech），PowerPacTM型电泳仪（Bio-Rad），RM2235型石蜡切片机（Lecia），M420型光学显微镜照相系统（Lecia），CX40型普通光学显微镜（Olympus），GZX-DH.500-BS-型电热恒温干燥箱（上海跃进医疗器械厂），SpectraMax 190型全波长酶标仪（美国MD公司），T100型Bio-Rad PCR仪（Bio-Rad），7500型q-PCR仪（Applied Biosystems），GloMax20/20型生物与化学发光检测仪（Promega），DW-86L578J型-80 超低温冰箱（海尔），RJ-TDL-50A型低速台式离心机（无锡市瑞江分析仪器有限公司），Z32HK型台式高速冷冻离心机（Hermle），FA2004型电子分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司），HH-4型水浴锅（常州国华电器有限公司），Smart-S15UVF型超纯水制备系统（上海子期实验设备有限公司）。方法1.分组与造模 雄性Wistar大鼠按随机数表随机分为正常对照组（22只）、糖尿病组（DM组，78只）。适应性饲养1周后，分别记录两组大鼠的体质量、进食量、饮水量、排泄量，并采of macrophage infiltration was observed by CD68 immunohistochemical staining in the four groups at 3rd,7th,14th and 21st day after wounding.Also,the protein and mRNA expression of GSK-3,IL-6,IL-10 in wound tissues were detected by ELISA and Q-PCR.Results:Compared with the control group,the wound macrophages in the model group showed a state of slow entry and slow exit,while Simiao group could improve the state.Compared with the control group,the protein and mRNA expression of GSK-3 and IL-6 in wound tissues in model group,Simiao group and LiCl group were increased(P0.05),while the wound