沉默环状RNA_胚胎致死异...4支持细胞增殖并促进其凋亡_史圣甲.pdf

论论著著文文章章编编号号：（）沉沉默默环环状状 胚胚胎胎致致死死异异常常视视觉觉样样蛋蛋白白 （）抑抑制制小小鼠鼠睾睾丸丸 支支持持细细胞胞增增殖殖并并促促进进其其凋凋亡亡史史圣圣甲甲，季季兴兴哲哲，孙孙建建华华，张张洲洲（西西北北妇妇女女儿儿童童医医院院生生殖殖中中心心，陕陕西西 西西安安 ；空空军军军军医医大大学学基基础础医医学学院院免免疫疫学学教教研研室室，陕陕西西 西西安安 ）收收稿稿日日期期：；接接受受日日期期：基基金金项项目目：陕陕西西省省卫卫健健委委卫卫生生健健康康科科研研基基金金（）；西西安安市市科科技技计计划划项项目目（）作作者者简简介介：史史圣圣甲甲（），男男，黑黑龙龙江江哈哈尔尔滨滨人人，主主治治医医师师，博博士士 ：；：通通讯讯作作者者，孙孙建建华华，：摘摘 要要 目目的的 观观测测沉沉默默环环状状 胚胚胎胎致致死死异异常常视视觉觉样样蛋蛋白白 （）对对小小鼠鼠睾睾丸丸 支支持持细细胞胞增增殖殖和和凋凋亡亡的的影影响响，并并探探索索潜潜在在机机制制。方方法法 应应用用小小干干扰扰 技技术术沉沉默默小小鼠鼠睾睾丸丸 细细胞胞 的的表表达达，沉沉默默 后后，采采用用 法法和和 乙乙炔炔基基 脱脱氧氧尿尿嘧嘧啶啶核核苷苷染染色色评评估估 细细胞胞增增殖殖能能力力，流流式式细细胞胞术术和和脱脱氧氧核核糖糖核核苷苷酸酸末末端端转转移移酶酶介介导导的的缺缺口口末末端端标标记记法法（）检检测测 细细胞胞的的凋凋亡亡。生生物物信信息息学学方方法法预预测测微微小小 （）与与 的的结结合合位位点点，荧荧光光素素酶酶报报告告实实验验检检测测 与与 的的结结合合能能力力。实实时时定定量量 检检测测 和和 表表达达水水平平。结结果果 沉沉默默 的的表表达达后后，细细胞胞增增殖殖速速度度和和 阳阳性性细细胞胞比比例例降降低低，凋凋亡亡细细胞胞比比例例增增加加。机机制制研研究究结结果果显显示示 可可结结合合并并下下调调 表表达达。结结论论 可可通通过过结结合合并并抑抑制制 表表达达促促进进小小鼠鼠 支支持持细细胞胞增增殖殖能能力力并并抑抑制制其其凋凋亡亡。关关键键词词 支支持持细细胞胞；环环状状 （）；环环状状 胚胚胎胎致致死死异异常常视视觉觉样样蛋蛋白白（）；微微小小 （）；细细胞胞增增殖殖；细细胞胞凋凋亡亡 中中图图分分类类号号 ，文文献献标标志志码码 （），；，：（，）（）（）（）（），；细胞与分子免疫学杂志（），（）DOI:10.13423/ki.cjcmi.009481 男男性性不不育育是是一一种种常常见见的的生生殖殖系系统统疾疾病病，其其中中伴伴有有精精子子发发生生障障碍碍、生生精精上上皮皮减减少少或或缺缺失失的的非非梗梗阻阻性性无无精精子子症症是是男男性性不不育育最最严严重重的的致致病病因因素素 。近近期期研研究究表表明明支支持持细细胞胞数数目目及及功功能能在在精精子子发发生生过过程程中中扮扮演演重重要要的的角角色色，其其可可通通过过提提供供结结构构、免免疫疫和和营营养养支支持持等等多多方方面面而而调调控控精精子子的的发发生生 。因因此此，探探索索支支持持细细胞胞数数目目和和功功能能的的调调控控机机制制，将将有有助助于于加加深深精精子子发发生生机机制制的的认认识识。环环状状 （，）是是一一类类新新的的内内源源性性非非编编码码 ，通通过过共共价价结结合合成成闭闭合合环环状状结结构构，无无 端端帽帽子子结结构构和和 端端多多聚聚 尾尾 。大大量量研研究究证证实实环环状状 可可通通过过调调控控关关键键基基因因的的表表达达而而在在多多种种疾疾病病的的发发生生及及进进展展中中起起到到举举足足轻轻重重的的作作用用 。但但是是，在在精精子子发发生生中中的的功功能能和和机机制制相相关关研研究究尚尚处处于于起起步步阶阶段段。胚胚胎胎致致死死异异常常视视觉觉样样蛋蛋白白 （，）在在生生精精功功能能正正常常的的睾睾丸丸组组织织中中高高表表达达，而而在在生生精精功功能能失失衡衡的的非非梗梗阻阻性性无无精精子子症症患患者者睾睾丸丸组组织织中中低低表表达达，是是精精子子发发生生潜潜在在的的调调控控因因子子 。来来源源于于 第第 至至 号号 外外 显显 子子 的的 环环 状状 （，）在在人人和和小小鼠鼠中中高高度度保保守守，但但其其在在精精子子发发生生中中的的 功功 能能 和和 机机 制制 尚尚 不不 清清 楚楚。本本 研研 究究 评评 估估 了了 对对小小鼠鼠支支持持细细胞胞系系 细细胞胞增增殖殖及及凋凋亡亡的的影影响响及及潜潜在在分分子子机机制制，以以期期揭揭示示 在在精精子子发发生生中中的的所所起起的的作作用用，为为临临床床非非梗梗阻阻性性无无精精子子症症治治疗疗提提供供可可靠靠有有效效的的治治疗疗靶靶点点。材材料料和和方方法法 材材料料 小小鼠鼠 支支持持细细胞胞系系购购自自武武汉汉普普诺诺赛赛公公司司；胎胎牛牛血血清清和和马马血血清清购购自自赛赛默默飞飞公公司司；、胰胰蛋蛋白白酶酶消消化化液液、蛋蛋白白裂裂解解液液、提提取取试试剂剂盒盒、法法试试剂剂盒盒、异异硫硫氰氰酸酸荧荧光光素素标标记记的的膜膜联联素素碘碘 化化 丙丙 啶啶（，）双双标标记记细细胞胞周周期期和和凋凋亡亡检检测测试试剂剂盒盒购购自自北北京京索索莱莱宝宝科科技技有有限限公公司司；和和 限限制制性性内内切切酶酶购购自自 公公司司；一一步步法法实实时时定定量量 试试剂剂盒盒购购自自北北京京康康为为世世纪纪公公司司；购购自自 公公司司；原原位位末末端端 转转 移移 酶酶 标标 记记 技技 术术（，）细细胞胞凋凋亡亡检检测测试试剂剂盒盒、乙乙炔炔基基 脱脱氧氧尿尿嘧嘧啶啶核核苷苷（，）增增殖殖检检测测试试剂剂盒盒、小小干干扰扰 （，）、小小干干扰扰 阴阴性性对对照照（，）、对对照照和和类类似似物物购购自自广广州州锐锐博博生生物物科科技技公公司司；紫紫外外分分光光光光度度计计购购自自 公公司司；流流式式细细胞胞仪仪购购自自 公公司司；荧荧光光定定量量 仪仪、多多功功能能酶酶标标仪仪购购自自 公公司司；荧荧光光显显微微镜镜购购自自 公公司司。方方法法 细细胞胞转转染染 将将 个个 细细胞胞铺铺至至 孔孔板板。细细胞胞约约长长满满 培培养养板板时时，取取 对对照照 类类似似物物滴滴加加至至 无无血血清清培培养养基基中中，制制备备试试剂剂 。取取 滴滴加加至至 无无血血清清培培养养基基中中，制制备备试试剂剂。将将试试剂剂和和试试剂剂轻轻柔柔混混合合，再再次次孵孵育育 ，制制备备转转染染试试剂剂。取取混混合合后后的的转转染染试试剂剂，逐逐滴滴滴滴加加至至 细细胞胞，后后将将细细胞胞培培养养液液更更换换为为完完全全培培养养基基。继继续续生生长长 后后，进进行行后后续续功功能能学学实实验验。将将转转染染 的的 细细胞胞命命名名为为对对照照组组，转转染染 的的 细细胞胞命命名名为为实实验验组组。提提取取 胰胰蛋蛋白白酶酶消消化化液液处处理理对对照照组组或或实实验验组组 细细胞胞，而而后后使使用用 裂裂解解液液裂裂解解实实验验组组和和对对照照组组 细细胞胞 ，应应用用 注注射射器器反反复复抽抽吸吸数数次次，从从而而使使细细胞胞充充分分裂裂解解。加加入入 氯氯仿仿，振振荡荡 ，室室温温静静置置约约 。、离离心心 后后，吸吸取取离离心心产产物物的的水水相相层层。加加入入 体体积积的的乙乙醇醇，将将混混合合物物转转移移至至吸吸附附柱柱中中。、离离心心 后后，加加 入入 去去 蛋蛋 白白 液液。、再再次次离离心心 ，而而后后加加入入 漂漂洗洗液液。、离离心心 ，去去除除残残留留试试剂剂。向向离离心心后后沉沉淀淀中中，加加入入 去去 酶酶的的 ，室室温温放放置置 后后，、离离心心 ，所所得得液液体体即即为为细细胞胞总总 ，测测定定 纯纯度度与与浓浓度度，备备用用。实实时时定定量量 检检测测对对照照组组或或实实验验组组 细细胞胞的的 和和 表表达达水水平平 按按前前述述方方法法提提取取对对照照组组或或实实验验组组 细细胞胞 。而而后后，按按照照一一步步法法实实时时定定量量 说说明明书书所所述述组组分分，配配置置一一步步法法实实时时定定量量 反反应应试试剂剂：，或或对对照照的的正正义义及及反反义义引引物物各各 ，细胞与分子免疫学杂志（），（），模模板板 （），去去 酶酶 补补齐齐至至 。振振荡荡混混匀匀后后，离离心心 使使混混合合液液至至管管底底。将将八八连连管管放放置置在在 机机中中，设设置置 反反应应条条件件为为：反反转转录录 ；（预预变变性性 、变变性性 、退退火火 延延伸伸 ）个个循循环环；保保存存样样品品。正正义义引引物物为为 ，反反义义引引物物为为 ；正正 义义 引引 物物 为为 ，反反 义义 引引 物物 为为 ；正正义义引引物物为为 ，反反 义义 引引 物物 为为 ；正正义义引引物物为为 ，反反义义引引物物为为 ；和和 为为内内参参，相相对对表表达达水水平平计计算算公公式式 。法法检检测测 细细胞胞增增殖殖 按按照照每每孔孔 个个细细胞胞，接接种种对对照照组组或或实实验验组组 细细胞胞至至 孔孔板板，每每组组各各设设置置 个个复复孔孔，共共接接种种五五板板。过过夜夜培培养养后后，向向对对照照组组或或实实验验组组 细细胞胞接接种种孔孔中中加加入入 溶溶液液，孵孵育育 后后，应应用用酶酶标标仪仪在在 记记录录吸吸光光度度（）值值，所所获获数数值值为为实实验验组组和和对对照照组组细细胞胞第第 天天吸吸光光度度（）值值。后后，对对照照组组或或实实验验组组 细细胞胞再再次次各各取取一一板板，重重复复上上述述步步骤骤，连连续续检检测测，获获取取第第 至至第第 天天 值值。将将两两组组细细胞胞第第 至至第第 天天 值值录录入入 软软件件，绘绘制制细细胞胞增增殖殖曲曲线线。检检测测 细细胞胞增增殖殖活活性性 向向对对照照组组或或实实验验组组 细细胞胞加加入入 培培养养液液，室室温温条条件件下下孵孵育育 。清清洗洗后后，向向对对照照组组或或实实验验组组 细细胞胞中中加加入入 甘甘氨氨酸酸，摇摇床床孵孵育育 。清清洗洗后后，向向两两组组细细胞胞中中加加入入 染染色色反反应应液液，室室温温避避光光摇摇床床孵孵育育 。清清洗洗后后，向向两两组组细细胞胞中中加加入入 ，摇摇床床孵孵育育 。清清洗洗后后，向向两两组组细细胞胞中中加加入入 染染色色体体液液，室室温温避避光光摇摇床床孵孵育育 。清清洗洗细细胞胞后后，荧荧光光显显微微镜镜拍拍照照。检检测测 细细胞胞凋凋亡亡 向向对对照照组组和和实实验验组组 细细 胞胞 加加 入入 细细 胞胞 固固 定定 液液，孵孵 育育 。清清洗洗后后加加入入 渗渗透透剂剂，孵孵育育 。清清洗洗后后，向向对对照照组组和和实实验验组组 细细胞胞加加入入 末末端端脱脱氧氧核核苷苷酸酸转转移移酶酶，孵孵育育 。向向对对照照组组和和实实验验组组 细细胞胞加加入入 柠柠檬檬酸酸钠钠缓缓冲冲液液（，）孵孵育育 。清清洗洗 次次后后，加加入入 染染色色液液，室室温温避避光光摇摇床床孵孵育育 ，清清洗洗 次次后后，荧荧光光显显微微镜镜拍拍照照。流流式式细细胞胞术术检检测测 细细胞胞凋凋亡亡 胰胰蛋蛋白白酶酶消消化化液液处处理理对对照照组组或或实实验验组组 细细胞胞，反反复复清清洗洗细细胞胞后后，向向对对照照组组或或实实验验组组 细细胞胞沉沉淀淀加加入入 结结合合缓缓冲冲液液，重重悬悬并并调调整整细细胞胞数数至至 个个 。向向 个个对对照照组组或或实实验验组组 细细 胞胞 加加 入入 染染色色液液 ，室室温温避避光光孵孵育育 。清清洗洗细细胞胞后后，向向对对照照组组或或实实验验组组细细胞胞加加入入 染染色色液液 ，室室温温避避光光孵孵育育 。清清洗洗细细胞胞后后，向向对对照照组组或或实实验验组组细细胞胞沉沉淀淀加加入入 ，细细胞胞重重悬悬混混匀匀后后，流流式式细细胞胞仪仪检检测测。荧荧光光素素酶酶报报告告基基因因 合合成成 全全长长序序列列，应应用用 和和 酶酶对对荧荧光光素素酶酶报报告告载载体