超高效液相色谱-串联质谱法检测食品中腰果过敏原_宁亚维.pdf

安全检测 食品科学 2023,Vol.44,No.04 329超高效液相色谱-串联质谱法检测食品中 腰果过敏原宁亚维1，杨 正1，马俊美2，刘 茁1，陈 佳3,*，李 强2,*（1.河北科技大学食品与生物学院，河北 石家庄 050018；2.河北省食品检验研究院，河北 石家庄 050000；3.石家庄学院化工学院，河北 石家庄 050035）摘 要：基于超高效液相色谱-串联质谱系统建立食品中腰果过敏原的定量检测方法。腰果经提取、胰蛋白酶酶解、净化后，经Easy-nLC 1000纳升液相色谱分离，随后进入四极杆-静电场轨道离子阱高分辨质谱以全扫描模式进行数据采集，使用ProteinPilot软件结合Uniprot蛋白数据库对样品扫描结果进行分析，并基于基本局部比对搜索工具（BLAST）验证肽段特异性，最终筛选出6 条腰果特异性肽段，利用超高效液相色谱-三重四极杆质谱系统的多反应监测模式对实际样品进行检测。结果表明，该方法在0.00510 mg/mL范围内线性关系良好，R2均大于0.99，固体基质中定量限为2.55 mg/kg，饮料基质中定量限为0.0050.01 mg/mL，平均回收率在82.5%109.9%之间，相对标准偏差不大于8.9%。该方法灵敏度高、特异性好，可用于饼干、面包、蛋糕、桃酥、巧克力和饮料6 种食品基质中的腰果过敏原检测。关键词：超高效液相色谱-串联质谱；腰果过敏原；检测Detection of Cashew Allergens in Foods by Ultra-high Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass SpectrometryNING Yawei1,YANG Zheng1,MA Junmei2,LIU Zhuo1,CHEN Jia3,*,LI Qiang2,*(1.College of Food and Biology,Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang 050018,China;2.Hebei Food Inspection and Research Institute,Shijiazhuang 050000,China;3.Institute of Chemical Technology,Shijiazhuang University,Shijiazhuang 050035,China)Abstract:A quantitative method for the detection of cashew allergens in foods was established based on ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS).Cashew samples were extracted,trypsinized,purified,and separated using an Easy nLC 1000 nano-liquid chromatograph,and then data were collected in the full-scan acquisition mode by quadrupole/orbitrap high-resolution mass spectrometry.The scanning results were analyzed by ProteinPilot software search against the UniProt protein database,and the peptide specificity was verified using the basic local alignment search tool(BLAST).Finally,six cashew specific peptides were selected,and actual samples were detected by UPLC-quadrupole/orbitrap MS in the multi-reaction monitoring(MRM)mode.The results showed that the proposed method had good linearity in the range of 0.00510 mg/mL with correlation coefficients(R2)greater than 0.99.The quantitation limit was 2.55 mg/kg and 0.0050.01 mg/mL for solid-state and beverage matrices,respectively.The average recoveries were 82.5%109.9%,and the relative standard deviation(RSD)was not more than 8.9%.This method has high sensitivity and specificity,and it can be used for the detection of cashew allergens in six food substrates including biscuit,bread,cake,walnut cookie,chocolate and beverage.Keywords:ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry;cashew allergens;detectionDOI:10.7506/spkx1002-6630-20220411-119中图分类号：TS20 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2023）04-0329-08收稿日期：2022-04-11基金项目：河北省“三三三人才工程”资助项目（A202005015）；河北省重点研发计划项目（20327125D）第一作者简介：宁亚维（1983）（ORCID:0000-0003-1128-6940），女，教授，博士，研究方向为食品生物技术与食品安全。E-mail:*通信作者简介：陈佳（1982）（ORCID:0000-0001-9714-1843），女，讲师，博士，研究方向为食品生物技术与安全。E-mail:chenjia-李强（1981）（ORCID:0000-0001-5744-1403），男，正高级工程师，硕士，研究方向为食品安全。E-mail:330 2023,Vol.44,No.04 食品科学 安全检测引文格式：宁亚维,杨正,马俊美,等.超高效液相色谱-串联质谱法检测食品中腰果过敏原J.食品科学,2023,44(4):329-336.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220411-119.http:/NING Yawei,YANG Zheng,MA Junmei,et al.Detection of cashew allergens in foods by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometryJ.Food Science,2023,44(4):329-336.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220411-119.http:/近年来，食物过敏在世界范围内的发生率呈现上升趋势，食物过敏已成为仅次于微生物污染的第2大食品安全问题1。据数据研究显示，食物过敏在成年人中的患病率约为5%，儿童由于自身的免疫系统尚未发育成熟，患病率约为8%2。当患者接触过敏原时，典型的过敏症状包括呕吐、腹泻、呼吸困难以及皮肤表面出现荨麻疹等，但也有患者出现比较严重的过敏性休克等危及生命的症状3。现阶段对于食物过敏尚无有效的治疗手段，避免接触食物过敏原是避免消费者诱发过敏反应的唯一方法4。为了给消费者提供更可靠的食品信息，各国均制定了严格的食品过敏原标注要求5-7，但由于各国对食品标签要求不尽相同，因此过敏原信息标注存在差异，同时食品标签难以对食品在生产、运输和贮存过程中由于交叉污染而产生的隐性过敏原进行标注，这给过敏人群造成了潜在的风险8。为了帮助过敏患者规避食品中的过敏原，同时监督食品标签准确性，开发食品过敏原高灵敏度检测方法十分重要。常见的食品过敏原主要包括花生、鸡蛋、牛奶、大豆、坚果、含麸质的谷物、鱼类和贝类八大类9。腰果与核桃、杏仁和榛子并称为世界四大坚果10，具有丰富的营养价值。然而腰果中存在坚果过敏原，可引起体温下降、腹部疼痛、全身瘙痒及呼吸困难的食物过敏症状11。现阶段用于腰果过敏原的检测技术主要有酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法12-13、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）法14-15 以及液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectromotry，LC-MS）法16-19。其中，ELISA为现阶段过敏原检测技术中最为成熟的方法。该方法以致敏蛋白为检测依据，基于抗原和抗体间的特异性结合反应进行检测。Zhao Yiqing等12以Ana o 3为蛋白标记物，开发了一种双抗体夹心ELISA法用于检测预包装食品中的残留腰果成分。在饼干基质和巧克力基质中的定量限（limit of quantitation，LOQ）分别为40 mg/kg和4 mg/kg，在巧克力中回收率为74.0%87.7%，但在饼干中的回收率仅为40.2%44.9%，回收率较低。由此可见尽管ELISA技术检测过敏原存在具有特异性强、灵敏度高的优势，但针对经过烹煮、煎炒等高强度加工处理的食品，通常会因特异性结合表位的损伤而导致致敏蛋白难以被特异性抗体识别，因而存在假阴性结果20。PCR法依赖致敏蛋白的DNA进行检测，避免了加工手段对致敏蛋白检测的影响，但该方法通过DNA间接检测致敏蛋白，且核酸在提取过程中易于受到污染而出现假阳性结果21。而食品在加工过程中不会造成蛋白质一级结构氨基酸序列的改变，因此基于过敏原特征肽段的质谱检测技术可以改善ELISA的假阴性和PCR假阳性的问题，具有较好地开发潜力。目前使用液相色谱-串联质谱法检测腰果过敏原的文献已有报道，Bignardi等16选取VFDCGVR为腰果特异性肽段，利用液相色谱-电喷雾串联质谱法结合快速固相萃取技术，提高了饼干和巧克力中腰果的检测灵敏度，其中在巧克力中腰果的定量限为50 mg/kg；Bignardi等22建立了液相色谱-串联质谱检测法检测加工食品中的腰果过敏原，定量限为10 mg/kg；Lee等23采用液相色谱-质谱法结合多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）技术显著提高了检测饼干中的腰果过敏原，定量限为46 mg/kg。近年来，我国研究人员也逐渐对LC-MS联用技术检测食品过敏原引起重视，在2019年颁布了GB/T 381632019常见过敏蛋白的测定 液相色谱-串联质谱法，标准中规定了固态食品中牛奶、鸡蛋、花生、榛子、杏仁、大豆和核桃过敏蛋白的液相色谱-质谱检测法，但目前我国还没有针对液相色谱-质谱检测腰果过敏原的相关报道。基于质谱技术在过敏原检测中准确、稳定且高效的优点，本研究采用Easy-nLC 1000纳升液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱（Easy-nLC 1000-Q-Exactive）筛选腰果过敏原特异性肽段，并通过超高效