常压室温等离子体诱变与微生...滴培养选育谷胱甘肽高产菌株_凌思雨.pdf

200 2023,Vol.44,No.04 食品科学 生物工程常压室温等离子体诱变与微生物微液滴培养 选育谷胱甘肽高产菌株凌思雨，王 洲，张会敏，李 闯，刘庆涛，刘 艳，薛正莲*（安徽工程大学生物与食品工程学院，安徽省工业微生物分子育种工程实验室，微生物发酵安徽省工程技术研究中心，安徽 芜湖 241000）摘 要：为提升野生毕赤酵母菌株BY-1产谷胱甘肽的能力，通过常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）诱变技术得到诱变菌株BY-1-26。进一步在摇瓶培养过程中添加1,2,4-三氮唑，提高诱变菌株产量。最后将1,2,4-三氮唑作为筛选因子，利用微生物微液滴培养（microbial microdroplet culture system，MMC）仪对诱变菌株进行适应性进化，获得了1 株高产谷胱甘肽的突变株BY-2-24，并对其遗传稳定性进行研究。结果表明：出发菌株BY-1经过ARTP诱变处理、抗性梯度平板初筛、MMC适应性进化、摇瓶复筛等，可以选育高产谷胱甘肽突变株。突变株BY-2-24摇瓶产量达（312.132.62）mg/L，较出发菌株提高134.26%，且经过7 次传代培养，仍然具有较好的遗传稳定性。同时，生物量提高118.33%，表明诱变菌株的生长能力得到提高。研究表明，ARTP与MMC联合应用作为一种简便高效的微生物诱变方式，可用于定向诱变筛选高性能微生物菌株，为高通量选育目标菌株提供了参考。关键词：谷胱甘肽；毕赤酵母；常压室温等离子体诱变；适应性进化；菌种筛选Breeding of a High-Yield Glutathione-Producing Strain by Atmospheric and Room Temperature Plasma Mutagenesis and Microbial Microdroplet Culture SystemLING Siyu,WANG Zhou,ZHANG Huimin,LI Chuang,LIU Qingtao,LIU Yan,XUE Zhenglian*(Anhui Engineering Laboratory for Industrial Microbiology Molecular Breeding,Anhui Engineering Technology Research Center of Microbial Fermentation,College of Biology and Food Engineering,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China)Abstract:In order to improve the ability of a wild-type strain(BY-1)of Pichia pastoristoproduceglutathione(GSH),amutantstraindesignatedBY-1-26wasobtainedbyatmosphericandroomtemperatureplasma(ARTP)mutagenesis.Tofurtherimprovetheproductionofglutathionebythemutantduringshakeflaskculture,1,2,4-triazolewasaddedtotheculture medium.Finally,adaptive evolution of the mutant strain was carried out on a microbial microdroplet culture system(MMC)using1,2,4-triazoleasascreeningfactor.Asaresult,ahigh-yieldglutathione-producingmutantstrainBY-2-24wasobtained,anditsgeneticstabilitywasinvestigated.Theresultsshowedthatahigh-yieldglutathione-producingmutantstraincouldbeobtainedusingthewild-typestrainBY-1byARTPmutagenesis,primaryresistancescreeningongradientplates,adaptiveevolutiononMMCandshake-flasksecondaryscreening.TheyieldofglutathioneproducedbyBY-2-24inshakeflaskculturewas(312.132.62)mg/L,which was 134.26%higherthanthatproducedbytheoriginalstrain,and this mutant stillhadgoodgeneticstabilityaftersevenpassages.Meanwhile,thebiomasswasincreasedby118.33%,indicatingthatthegrowthabilityofthemutantstrainwasimprovedcomparedtotheoriginalstrain.TheresultofthisstudyshowthatthecombinationofARTPandMMCcanbeusedasasimpleandeffectivescreeningmethodforexcellentmutantstrains,whichprovidesareferenceforhighthroughputselectionoftargetstrains.Keywords:glutathione;Pichia pastoris;atmospheric and room temperature plasma;adaptive evolution;strain selectionDOI:10.7506/spkx1002-6630-20220302-040中图分类号：Q815 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2023）04-0200-09收稿日期：2022-03-02基金项目：安徽省高校自然科学研究项目（KJ2017A120）第一作者简介：凌思雨（1996）（ORCID:0000-0001-6568-6654），女，硕士研究生，研究方向为微生物发酵工程。E-mail:*通信作者简介：薛正莲（1967）（ORCID:0000-0002-5913-9096），女，教授，硕士，研究方向为工业微生物育种。E-mail:生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.04 201引文格式：凌思雨,王洲,张会敏,等.常压室温等离子体诱变与微生物微液滴培养选育谷胱甘肽高产菌株J.食品科学,2023,44(4):200-208.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220302-040.http:/LING Siyu,WANG Zhou,ZHANG Huimin,et al.Breeding of a high-yield glutathione-producing strain by atmospheric and room temperature plasma mutagenesis and microbial microdroplet culture systemJ.Food Science,2023,44(4):200-208.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220302-040.http:/谷胱甘肽是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的非蛋白类三肽化合物1，广泛存在于大多数真核生物和某些原核生物中2。在生物体内具有还原型和氧化型两种形式3，其中还原型谷胱甘肽占大多数，约为90%4-5。由于其具有抗氧化性6、清除自由基7、解毒8、美白9等 功能，谷胱甘肽被广泛应用于食品、医药和化妆品等行业3,10。因此，近年来国内外对谷胱甘肽的需求呈现出一种上升趋势11。目前，酵母发酵法生产谷胱甘肽是工业生产上的主流，常用的生产菌种主要包括酿酒酵母12-13、产朊假丝酵母14和毕赤酵母15。由于传统的菌种选育方法过程繁琐、效率低下16，由清华大学与天木生物科技有限公司合作研发的常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）诱变技术可有效解决上述问题。ARTP诱变具有高突变率、操作简单、诱变速度快且对环境无污染等优点17-18，是一种新型诱变技术，已被广泛应用到各类微生物菌种筛选过程中19。同时，基于液滴微流控技术研发而成的一款全自动高通量微生物微液滴培养（microbial microdroplet culture system，MMC）系统具有高通量、微量化及自动培养和传代等功能20-21，为菌种诱变之后的复杂筛选工作提供了一种高效方法22-23。目前，将ARTP与MMC联合应用于菌种选育的相关研究还鲜见报道，因此具有一定的研究前景和理论价值。为了获得高产谷胱甘肽的毕赤酵母菌株，以实验室保藏的1 株毕赤酵母BY-1作为出发菌株，首先通过ARTP诱变技术并结合梯度浓度1,2,4-三氮唑平板筛选方法，验证在高质量浓度1,2,4-三氮唑抗性平板上生长菌株的谷胱甘肽产量，明显高于低浓度1,2,4-三氮唑平板上生长的菌株。然后进一步以1,2,4-三氮唑作为筛选因子，利用MMC对经过诱变的菌株进行适应性进化，提高出发菌株对1,2,4-三氮唑耐受性的同时筛选出高产谷胱甘肽的毕赤酵母菌株。本实验旨在将ARTP诱变技术与MMC适应性进化联合应用于高产谷胱甘肽毕赤酵母菌株的选育，相比传统的物理诱变、化学诱变和生物合成学手段 相比，提供一种简便高效的育种方式，具有广泛的市场应用价值。1 材料与方法1.1 材料与试剂1.1.1 菌种毕赤酵母（Pichia pastoris）菌株，本实验室命名为BY-1。1.1.2 培养基菌种培养用液体和固体培养基为酵母浸出粉胨葡萄糖（yeastextractpeptonedextrose，YPD）培养基：葡萄糖20g/L，胰蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L；固体培养基中额外添加20g/L琼脂粉。诱变菌株进行摇瓶培养所用液体培养基：葡萄糖20g/L，酵母提取物10g/L，硫酸铵5g/L，无水磷酸二氢钾5g/L，七水硫酸镁5g/L，氯化钠0.1g/L，氯化钙0.1g/L。培养基需115 灭菌30 min后使用。1.1.3 试剂1,2,4-三氮唑、Tris-HCl缓冲液、2-硝基苯甲酸（2-nitrobenzoicacid，DTNB）生工生物工程（上海）股份有限公司；40%乙醇溶液 国药集团化学试剂有限 公司。1.2 仪器与设备ARTP-IIS ARTP诱变育种仪 无锡源清天木生物科技有限公司；MMC-B2 MMC培养仪 洛阳华清天木生物科技有限公司；1510酶标仪 赛默飞世尔（上海）仪器有限公司；D3024高速微量离心机 大龙兴创实验仪器（北京）股份公司；ZQZY-78BN恒温培养摇床 上海知楚仪器有限公司；Mixer4K微型旋涡混合仪 生工生物工程（上海）股份有限公司。1.3 方法1.3.1 毕赤酵母ARTP诱变1.3.1.1 BY-1菌株生长曲线制作及对数生长期的确定将活化好的毕赤酵母菌（BY-1）转移至装液量为30 mL的250 mL摇瓶中，置于恒温培养摇床中30、220 r/min过夜培养。将BY-1菌悬液浓度稀释到OD600 nm约1.0，转入MMC专用进样瓶，在MMC系统中创建液滴培养单元，并使用MMC系统自带的光密度检测装置检测液滴中BY-