超高效液相色谱串联质谱法测...葡萄酒中酚酸和酚醛类化合物_马燕玲.pdf

第 卷第 期化学试剂 分析与测试超高效液相色谱串联质谱法测定葡萄酒中酚酸和酚醛类化合物马燕玲，王一名，初坤，陈晨，吴帅（烟台市食品药品检验检测中心，山东 烟台；青岛市农业科学研究院，山东 青岛）摘要：建立了超高效液相色谱三重四极杆串联质谱法检测葡萄酒中 种酚酸和酚醛类物质的方法。将葡萄酒经.滤膜过滤后进样，选用 色谱柱（.，.），以.（）甲酸乙腈溶液.（）甲酸水溶液为流动相，采用梯度洗脱方式，对酚类物质进行分离。选择电喷雾离子源（），采用多反应监测（）的模式，优化质谱参数。实验结果表明，种酚酸和酚醛类物质在各自的质量浓度范围内均呈良好的线性关系，检出限在.之间，定量限在.之间，平均回收率为.，精密度为.。利用上述方法对葡萄酒样品进行分析，结果表明，所有葡萄酒中均含有没食子酸、咖啡酰酒石酸、对羟基苯甲酸、丁香酸、香草酸等酚类物质，未检出原儿茶酸、鞣花酸、水杨酸和肉桂酸等，部分酒样中检出芥子酸。该方法能够满足葡萄酒酚酸和酚醛类物质检测的定量和定性要求。关键词：超高效液相色谱串联质谱法；葡萄酒；酚酸类；酚醛类；过滤中图分类号：文献标识码：文章编号：（）：，（，；，）：.（.，.）.（）.（）（）（）（）.（）.，：；收稿日期：；网络首发日期：基金 项 目：国 家 市 场 监 督 管 理 总 局 科 技 计 划 项 目（）。作者简介：马燕玲（），女，山东烟台人，硕士，工程师，主要从事农产品质量风险评估的研究。通讯作者：吴帅，：。引用本文：马燕玲，王一名，初坤，等超高效液相色谱串联质谱法测定葡萄酒中酚酸和酚醛类化合物化学试剂，（）：。葡萄酒香气浓郁、口感丰富，酿造历史悠久。近年来，因其具有较高的营养保健功能，受到越来越多消费者的青睐。葡萄酒中含有种类丰富的有机酸、氨基酸、单宁、酚类和香气物质等，其中酚类化合物作为植物体内的次生代谢物，对葡萄酒的质量至关重要。酚类化合物是一类具有大而复杂结构的化合物，从本质上讲酚是苯环（又称芳香环）上直接连有一个或多个羟基的化合物，多酚物质是含有酚官能团的物质。酚类物质化学试剂 第 卷第 期是葡萄中重要的次生代谢产物，与葡萄的抗病性、保鲜特性和果实品质等有密切的关系。葡萄酒中的酚类物质主要可分为类黄酮和非类黄酮，非类黄酮类物质不具有类黄酮 结构，主要包括酚酸类化合物（羟基苯甲酸类、羟基肉桂酸类）。酚酸类物质除了具备多酚共有的强抗氧化能力外，在葡萄酒发酵和陈酿过程中还参与多种氧化还原反应和褐变反应，如咖啡酸、香豆酸等能与酒石酸和花色素结合成酒石酸酯，影响葡萄酒的氧化过程和颜色稳定性；一些酚酸类的前体物质，如丁香醛和香草醛等，既可以赋予葡萄酒特殊的香气，也表现出一定的辅色能力，影响葡萄酒的颜色和风味。酚类物质对于葡萄酒的颜色具有重要的作用。葡萄酒中多酚种类较多、含量不一，在不同品种、类型、产地、成熟度及陈酿条件下，所占比例不同，因此分析葡萄酒中酚类物质的含量具有重要意义。目前针对酚类物质的检测已有一些报道，主要分析方法有高效液相色谱法（）、毛细管电泳分析法（）、高效液相色谱质谱联用法（），等。等采用 在 分析柱上分离葡萄酒中 种生物 活 性 酚 类 成 分。等采 用 在酚类物质的基础上，对克罗地亚甜葡萄酒和干葡萄酒进行鉴别。从文献资料来看，检测的缺陷在于其仪器运行时间长，且葡萄酒成分复杂，待测化合物与干扰物的有效分离仍是难点，用二极管阵列检测器定性时，存在假阳性的可能。受葡萄酒样品基质的影响非常大，灵敏度低。与前两种方法相比，具有分析速度快、选择性好、灵敏度高的优点，受到越来越多研究人员的关注。目前研究葡萄酒酚酸和酚醛类化合物时多采用，而利用 研究相关内容的文章还未见报道。本研究建立了超高效液相色谱三重四极杆串联质谱法同时测定葡萄酒中酚酸和酚醛类化合物的方法，并应用于实际样品的检测。实验部分.主要仪器与试剂 型超高效液相色谱三重四极杆串联质谱联用仪（美国 公司）；型台式冷冻离心机（上海精科天美公司）；型多管涡旋振荡器（德国 公司）；型氮吹仪（美国 公司）；型电子天平（美国奥豪斯公司）；型超纯水机（美国 公司）。没食子酸、咖啡酰酒石酸、咖啡酸、肉桂酸（成都普菲德生物技术有限公司）；丁香酸、对羟基苯甲酸、对香豆酸和芥子酸（美国 公司）；香草酸、阿魏酸、原儿茶酸、鞣花酸、水杨酸、绿原酸、香草醛、龙胆酸、，二羟基苯甲酸（成都普瑞法科技开发有限公司）；丁香醛（德国 公司）；甲酸、甲醇、乙腈（色谱纯，美国 公司）；乙酸乙酯、乙醚（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；实验用水为自制超纯水。葡萄酒购买于超市。.实验条件.色谱条件 色谱柱（.，.），柱温 ；流动相 为.（）甲酸水溶液，为.（）甲酸乙腈溶液，流速.；进样量 。梯度洗脱程序：，；.，；.，；，；，；.，；.，。.质谱条件电喷雾离子源正离子（）模式下的毛细管电压为.，电喷雾离子源负离子（）模式下的毛细管电压为.；脱溶剂气温度为，脱溶剂气流速为 ，锥孔气流速为 ，碰撞气流速为.。.实验方法.标准溶液的配制单标准溶液（）：称取 标准品，用甲醇超声溶解并定容至 棕色容量瓶中，置于 保存备用。混合标准储备液（）：分别取 单标准溶液，用甲醇定容至 容量瓶中，置于 保存备用。.模拟酒样的配制取 食用酒精和 食品级酒石酸，移到 容量瓶中，用去离子水定容，即得到模拟酒样。.预处理方法溶剂提取法，：取 模拟酒样，加入第 卷第 期马燕玲等：超高效液相色谱串联质谱法测定葡萄酒中酚酸和酚醛类化合物 乙酸乙酯或无水乙醚，涡旋振荡后，离心，取上清液，重复萃取 次，合并有机相，氮气吹至近干，用 甲醇溶解残渣，过滤膜，上机分析。直接进样法：葡萄酒样品经.微孔滤膜过滤，在仪器工作条件下进行分析。结果与讨论.质谱条件的选择选择电喷雾离子源（），采用多反应监测（）模式对待测物的质谱条件进行优化。在正离子和负离子模式下，以流动注射方式将待测物标准溶液注入质谱仪进行全扫描，。结果显示，没食子酸、咖啡酰酒石酸、丁香酸、鞣花酸、绿原酸和芥子酸等 种化合物在负离子模式下响应值较高且峰形更好（基峰均为），而其他化合物如对羟基苯甲酸、对香豆酸、水杨酸等在正离子模式下的响应值更高（基峰均为），所以分别选择正、负离子模式进行检测。选定各自的母离子，在 模式下对其进行轰击寻找子离子，选取干扰较小、信噪比最高的离子对进行监测，确定定量和定性离子对。通过对毛细管电压、锥孔电压、离子源温度、脱溶剂气温度、接口温度、去溶剂气和锥孔反吹气流速等参数进一步优化，从而确定质谱运行参数。具体分析参数见表。表 酚酸和酚醛类化合物的质谱参数注 化合物英文名称质荷比 母离子子离子碰撞能量 锥孔电压 没食子酸 咖啡酰酒石酸 对羟基苯甲酸 丁香酸 香草酸 对香豆酸 阿魏酸 咖啡酸.原儿茶酸，鞣花酸 水杨酸 绿原酸 芥子酸 肉桂酸 香草醛丁香醛龙胆酸，二羟基苯甲酸，注：“”为定量离子。.色谱柱的选择根据待测成分的特点，选择 色谱柱（.，.）和 色谱柱（.，.）为试验用色谱柱。考察待测物在两支色谱柱上的分离效果，结果显示，待测物在色谱柱上的分离效果相差不大。对比相同待测物在 色谱柱和 色谱柱上响应值的比值，计算结果见表。由表可知，待测物在 色谱柱上的响应值均高于 色谱柱。与 色谱柱相比，咖啡酰酒石酸和水杨酸在 色谱柱上的响应值高 以上；对羟基苯甲酸、原儿茶酸、对香豆酸、鞣花酸、绿原酸、龙胆酸、，二羟基苯甲酸在 色谱柱上的响应值高约；丁香醛的响应值增加幅度最低，高约，其余 种组分的响应值高约 。考虑到待测物在 色谱柱上的响应信号更好，本实验选择 色谱柱作为待测物分析用色谱柱。化学试剂 第 卷第 期表 酚酸和酚醛类化合物在 和 色谱柱上响应信号的对比 化合物 响应比值 化合物 响应比值 没食子酸鞣花酸咖啡酰酒石酸水杨酸对羟基苯甲酸绿原酸丁香酸芥子酸香草酸肉桂酸对香豆酸香草醛阿魏酸丁香醛咖啡酸龙胆酸原儿茶酸，二羟基苯甲酸.流动相的选择以 色谱柱作为分析用色谱柱，分别选用.（）甲酸乙腈溶液.（）甲酸水溶液（）、乙腈.（）甲酸水溶液（）和乙腈水（）作为流动相，比较 种流动相对待测物的分离效果。结果显示，多数目标峰在加酸后的流动相中出峰效果更佳，以香草醛和丁香酸为例，其在流动相、中峰形更对称，如图、.（）甲酸乙腈溶液.（）甲酸水溶液；乙腈.（）甲酸水溶液；乙腈水图 香草醛在不同流动相中的色谱峰 .（）甲酸乙腈溶液.（）甲酸水溶液；乙腈.（）甲酸水溶液；乙腈水图 丁香酸在不同流动相中的色谱峰 所示；从峰面积来看，除丁香酸外，其他 种待测物在流动相和中的响应值均显著高于流动相。待测物在流动相和中的分离效果表现相似，但响应值存在差异。种化合物在两种流动相中的响应值相差 以上，其中没食子酸、咖啡酰酒石酸、原儿茶酸、龙胆酸和，二羟基苯甲酸在流动相中的响应值比流动相高约，香草酸、水杨酸和芥子酸在流动相中的响应值比流动相高约。综合待测物在 种流动相中的响应值和分离效果来看，选择.（）甲酸乙腈溶液.（）甲酸水溶液为流动相。.滤膜材质的影响由于葡萄酒中目标分析物的特性具有较大差别，不同材质滤膜对分析物的吸附能力也存在较大差异。在过滤时，滤膜会不同程度地改变分析物浓度，从而影响检测方法的准确性。本研究选择不同类型的针头式微滤膜过滤器：聚四氟乙烯（）、聚偏氟乙烯（）和尼龙（），直径均为 、孔径均为.，研究滤膜对检测方法的影响。将浓度为 的混合标准溶液，分别通过不同类型的滤膜，过滤体积均为 。同一份滤膜做 个平行样。根据过滤前后的浓度计算过膜率，结果见表。由数据可知，每种滤膜对酚类物质的吸附程度存在差异。膜材质为 时，咖啡酰酒石酸、鞣花酸和龙胆酸的过膜率均低于，香豆酸、咖啡酸、芥子酸、，二羟基苯甲酸的过膜率在 之间；膜材质为 时，鞣花酸的过膜率为.，二羟基苯甲酸的过膜率为.；香草酸的过膜率为.，其余待测物过膜率在 以上；膜材质为 时，所有待测物的过膜率均在 以上。因此，为了实现对目标物更为准确的定性和定量分析，本实验选择 作为试验用滤膜。表 滤膜对酚酸和酚醛类化合物过膜率的影响 化合物过膜率 没食子酸.咖啡酰酒石酸.对羟基苯甲酸.丁香酸.第 卷第 期马燕玲等：超高效液相色谱串联质谱法测定葡萄酒中酚酸和酚醛类化合物续表化合物过膜率 香草酸.对香豆酸.阿魏酸.咖啡酸.原儿茶酸.鞣花酸.水杨酸.绿原酸.芥子酸.肉桂酸.香草醛.丁香醛.龙胆酸.，二羟基苯甲酸.预处理方法对回收率的影响葡萄酒酚类物质检测方法的预处理方式有乙酸乙酯提取法、乙醚提取法和直接过膜法。在模拟酒样中添加固定浓度的标准品，比较不同预处理方式下各待测物的回收率，结果见表。表 预处理方式对酚酸和酚醛类化合物回收率的影响 化合物回收率 乙酸乙酯法乙醚法直接过膜法没食子酸.咖啡酰酒石酸.对羟基苯甲酸.丁香酸.香草酸.对香豆酸.阿魏酸.咖啡酸.原儿茶酸.鞣花酸.水杨酸.绿原酸.芥子酸.肉桂酸.香草醛.丁香醛.龙胆酸.，二羟基苯甲酸.由表可知，采用乙酸乙酯提取时，没食子酸、咖啡酰酒石酸、原儿茶酸、鞣花酸、水杨酸、绿原酸、芥子酸和，二羟基苯甲酸的回收率在之间；采用乙醚提取时，咖啡酰酒石酸和绿原酸的回收率低于，没食子酸、对羟基苯甲酸、，二羟基苯甲酸、丁香酸、原儿茶酸、鞣花酸和芥子酸的回收率在 之间；采用直接过膜法时，绿原酸的回收率最低，为.，其他成分的回收率均在 以上。考虑到方法的准确度和简便性，本方法选择样品直接过滤膜后，上机检测。.标准工作曲线的建立将混合标准储备液用甲醇稀释出 个浓度水平的标准工作溶液，按照仪器工作条件进行测定，每个浓度做 个平行，以峰面积 为纵坐标、质量浓度 为横坐标，计算得到标准曲线。分析可知，待测物标准品在各自的质量浓度范围内均呈良好的线性关系。分别以、倍信噪比（）计算检出限和定量限，结果见表。表 线性回归方程、线性范围、相关系数、检出限和定量限 ，化合物线性范围（）线性方程相关系数检出限（）定量限（）没食子酸 .咖啡酰酒石酸 .对羟基苯甲酸 .丁香酸 .香草酸 .对香豆酸 .阿魏酸 .咖啡酸 .原儿茶酸.鞣花酸.水杨酸 .绿原酸.芥子酸.肉桂酸 .香草醛 .丁香醛 .龙胆酸 .，二羟基苯甲酸.回