肠炎沙门菌活疫苗株Sm24...2_Ssq精准鉴定方法研究_李培勇.pdf

养禽与禽病防治2022 年第 8 期42-45.26 何太文,张利.裸花紫珠的内科临床应用研究进展J.特别健康,2019(24):229.27 郭闪闪,韩红霞.裸花紫珠颗粒治疗小儿细菌性上呼吸道感染临床疗效观察 J.黑龙江医药,2019,32(5):1059-1061.28李国萍,靳娜,于开军.裸花紫珠颗粒治疗小儿急性化脓性扁桃体炎 51 例疗效观察J.中国药业,2017,26(21):51-52.29 沈琳,王慧卿.裸花紫珠颗粒联合奥曲肽治疗肝硬化上消化道出血的效果分析 J.临床医学工程,2022,29(2):201-202.30高香奇,李诚丛,周星.黎药裸花紫珠与胆木组合的药效学研究 J.中国民族民间医药,2017,26(6):34-38.责任编辑：孙坚肠炎沙门菌活疫苗株 Sm24/Rif12/Ssq 精准鉴定方法研究李培勇1，栾贻豪1，孙淑红1,2,3*（1.山东农业大学动物科技学院，山东泰安271018；2.山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室，山东泰安271018；3.山东省畜禽疫病防制工程技术研究中心，山东泰安271018）摘要：肠炎沙门菌是一种重要的食源性病原菌，肠炎沙门菌活疫苗株 Sm24/Rif12/Ssq 在降低鸡群肠炎沙门菌流行率和降低食源性肠炎沙门菌感染等方面发挥了重要作用。但原有的肠炎沙门菌疫苗株与野生菌株的区分方法，目前已无法有效地区分疫苗株与其他菌株，因此，本试验在原有分离鉴定方法上进行了改进优化。首先利用疫苗株在 BPLS抗性平板和 XLD 平板上的生长特点进行区分，然后进行有氧和无氧条件下的三糖铁试验，最后通过萘啶酸药敏试验和 O:9 单因子血清平板凝集试验进行验证。结果表明，疫苗株在以上三步中均表现出独有的特点，本研究优化建立的鉴定方法精准有效，可用于区分肠炎沙门菌疫苗株与其他菌株。关键词：肠炎沙门菌疫苗株 Sm24/Rif12/Ssq精准鉴定肠炎沙门菌是一种重要的食源性病原菌，人感染后会导致胃肠道疾病，而鸡肉和鸡蛋被认为是肠炎沙门菌的主要来源1，因此，控制鸡群的肠炎沙门菌感染率对减少人类肠炎沙门菌感染尤为关键。雏鸡感染肠炎沙门菌后主要表现为急性肠道炎症，继而造成大批量死亡。成年鸡通常呈隐性感染，不发病但间接性向外排菌，从而造成持续性感染和鸡群内水平传播。此外，基 金 项 目：山 东 省 农 业 良 种 工 程 项 目（2020LZGC013）、山 东 省 重 点 研 发 计 划（2022CXGX010606）作者简介：李培勇（1997-），男，博士研究生，主要从事家禽沙门菌研究，E-mail：*通讯作者：孙淑红（1968-），女，博士，主要从事兽医公共卫生学研究，E-mail：sun-中图分类号：S855.1 文献标志码：A 文章编号：1008-3847（2022）08-0017-0617-养禽与禽病防治2022 年第 8 期对于种鸡而言，受感染的种鸡还会将病菌垂直传播给子代鸡群，造成世代间均感染。目前，种鸡场主要采取种源净化的措施控制沙门菌病，同时，疫苗免疫也是防控肠炎沙门菌的重要措施。肠炎沙门菌疫苗通常包括灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗和基因工程疫苗。相比于其他类型疫苗，减毒活疫苗因最大程度保留了菌株的抗原表位，能够更好地刺激机体产生体液免疫，提供最佳的保护效果。肠炎沙门菌活疫苗株 Sm24/Rif12/Ssq（AviProR Salmonella VacE,ELANCO）因发生了代谢漂移突变，使其缺乏某些基本的代谢途径和细胞外膜发生改变，这不仅降低了菌株毒力，还使菌株抗生素敏感性发生变化。疫苗株表现为对利福平和链霉素耐药，对红霉素和萘啶酸敏感的特点，并且此特点具有遗传稳定性2。肠炎沙门菌活疫苗株 Sm24/Rif12/Ssq 已在欧洲得到广泛应用，并在降低种鸡群的沙门菌流行水平、降低食源性沙门菌感染以及提高食品安全等方面发挥了重要作用3-5，而且由于疫苗株独特的抗生素抗性，使其易于从泄殖腔拭子或脏器中分离，并与野生株区分。但细菌耐药性的不断增强和种属间耐药基因的水平转移，原有的基于疫苗株对利福平和链霉素耐药的特点而建立的分离鉴定方法受到限制。因此，本试验在原有的疫苗株分离鉴定方法的基础上，结合疫苗株的生长特性、生化特性和抗生素敏感性，优化建立了新的肠炎沙门菌疫苗株Sm24/Rif12/Ssq 鉴定流程，达到了精准有效鉴定疫苗株的目的。1材料与方法1.1试验材料1.1.1菌种肠炎沙门菌活疫苗株 Sm24/Rif12/Ssq 由礼蓝（上海）动物保健有限公司提供；肠炎沙门菌标准株 CVCC3377 和鸡白痢沙门菌标准株CVCC526 均由中国兽医微生物菌种保藏管理中心提供；鼠伤寒沙门菌、肯塔基沙门菌、蒙得维的亚沙门菌、伦敦沙门菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯菌和大肠杆菌均分离自临床样本，由本实验室保存。1.1.2主要仪器恒温震荡培养箱（上海福玛实验设备有限公司）；生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）。1.1.3主要试剂木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂培养基、改良亮绿色酚红乳糖蔗糖（BPLS）琼脂培养基、三糖铁（TSI）琼脂培养基、Mueller-Hinton（MH）琼脂培养基、2.5 L圆底立式厌氧培养袋和 2.5 L厌氧产气包均为青岛海博生物技术有限公司产品；萘啶酸药敏片（30 g/mL）杭州滨和微生物试剂有限公司提供；O:9 单因子血清（宁波天润生物药业有限公司）；链霉素和利福平均由西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司提供。1.2试验方法1.2.1BPLS抗性平板和 XLD平板培养与观察将对数生长期的疫苗株、肠炎沙门菌标准株、鸡白痢沙门菌标准株、鼠伤寒沙门菌、肯塔基沙门菌、蒙得维的亚沙门菌、伦敦沙门菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯菌和大肠杆菌分别划线于 BPLS抗性平板（添加 200 g/mL链霉素和 100 g/mL利福平）和 XLD平板，置于 37 培养箱中培养 1820 h 后，观察是否生长、单菌落形态和平板颜色变化等生长特点。1.2.2三糖铁试验挑取 XLD 平板上的单菌落先在三糖铁培养基斜面上划线，再进行底层穿刺，每种菌接种3 管三糖铁培养基。完成接种的试管分别在有氧和无氧条件（厌氧培养袋配合厌氧产气包使用创造无氧条件）下培养 1820 h 后，观察并记录颜色变化、黑色沉淀产生情况和产气情况。1.2.3萘啶酸药敏试验和 O:9 单因子血清玻片凝集试验利用疫苗株对萘啶酸敏感和能够与 O:9 单18-养禽与禽病防治2022 年第 8 期菌株BPLS抗性平板XLD平板是否生长菌落形态颜色变化菌落形态颜色变化疫苗株是乳白色，光滑湿润变红乳白色，光滑湿润变红肠炎沙门菌标准株CVCC3377否-黑芯，边缘平滑透明变红鸡白痢沙门菌标准株CVCC526否-针尖状，光滑透明变红鼠伤寒沙门菌是乳白色，光滑湿润变红黑芯，边缘平滑透明变红肯塔基沙门菌否-黑芯，边缘平滑透明变红蒙得维的亚沙门菌否-黑芯，边缘平滑透明变红伦敦沙门菌否-黑芯，边缘平滑透明变红奇异变形杆菌否-黑芯，边缘平滑透明-肺炎克雷伯菌否-黄色，光滑湿润变黄大肠杆菌是乳白色，光滑湿润变黄黄色，光滑湿润变黄因子血清产生凝集反应的特点进行疫苗株确证试验。使用纸片扩散法进行萘啶酸药敏试验，蘸取对数生长期的疫苗株菌液，均匀涂抹在 MH平板上，再贴上萘啶酸药敏片，每个平板贴 2 片药敏片。置于 37 培养箱中培养 1824 h 后，使用游标卡尺测量抑菌圈直径，并根据萘啶酸药敏判定标准（R13，14I18，S19）进行判定。O:9 单因子血清玻片凝集试验使用疫苗株单菌落进行试验。2结果2.1生长特点区分结果不同菌株在 BPLS抗性平板和 XLD平板上具有不同生长特点，具体结果见表 1。结果表明，疫苗株在 BPLS 抗性平板上的形态为乳白色、光滑湿润，有菌落生长的区域平板会变红；在 XLD平板上的形态为乳白色，光滑湿润，无黑芯，有菌落生长的区域平板会变红。其他非疫苗株菌株在 BPLS抗性平板和 XLD平板上生长特点与疫苗株有所差别，因此，可依此区分疫苗株和非疫苗株。2.2三糖铁试验区分结果在有氧和无氧条件下，不同菌株的三糖铁试验结果不同，具体结果见表 2、图 1 和图 2。结果表明，在有氧条件下，接种疫苗株的三糖铁培养基斜面为红色，仅在穿刺的起始处有少量黑色沉淀，底部为黄色，不产气；在无氧条件下，接种疫苗株的三糖铁培养基斜面和底部均为黄色，无黑色沉淀，不产气。其他非疫苗株菌株三糖铁试验结果与疫苗株有所差别，因此，可依此区分疫苗株和非疫苗株。2.3萘啶酸药敏试验和 O:9 单因子血清玻片凝集试验结果表 1不同菌株在 BPLS 抗性平板和 XLD 平板的生长特点19-养禽与禽病防治2022 年第 8 期菌株有氧无氧斜面颜色黑色沉淀底部颜色是否产气斜面颜色黑色沉淀底部颜色是否产气疫苗株红色少量*黄色否黄色无黄色否肠炎沙门菌标准株CVCC3377红色大量黄色是黄色大量黄色是鸡白痢沙门菌标准株CVCC526黄色无红色否黄色无红色否鼠伤寒沙门菌红色大量黄色是黄色大量黄色是肯塔基沙门菌红色大量黄色是黄色大量黄色是蒙得维的亚沙门菌红色大量黄色是黄色少量黄色是伦敦沙门菌红色大量黄色是黄色大量黄色是奇异变形杆菌红色大量黄色是黄色大量黄色是肺炎克雷伯菌黄色无黄色否黄色无黄色否大肠杆菌黄色无黄色是黄色无黄色是表 2有氧和无氧条件下不同菌株三糖铁试验结果*备注：仅在穿刺起始处有少量黑色沉淀。图 1有氧条件下不同菌株三糖铁试验结果20-养禽与禽病防治2022 年第 8 期图 2无氧条件下不同菌株三糖铁试验结果萘啶酸药敏试验结果显示，萘啶酸对疫苗株的抑菌圈直径为 22 mm，判定为敏感；并且疫苗株能与 O:9 单因子血清发生明显的凝集反应，因此，可利用疫苗株这两个特点进行确证试验。2.4精准鉴定流程的建立根据以上结果，建立了精准鉴定肠炎沙门菌疫苗株 Sm24/Rif12/Ssq 的流程（图 3）。本流程首先利用疫苗株在 BPLS抗性平板和 XLD平板上的生长特点进行区分，然后进行有氧和无氧条件下的三糖铁试验，最后通过萘啶酸药敏试验和 O:9 单因子血清平板凝集试验进行确证试验。3讨论原有的疫苗株分离鉴定方法以抗生素筛选为主，再经过沙门菌属生化鉴定和血清型鉴定，最终达到鉴定疫苗株的目的。此方法因涉及生化鉴定，所以检测过程复杂、成本较高，而且由于野生株和疫苗株在 BPLS 平板上无法通过形态区分，会遗漏对利福平和链霉素耐药的野生株。因此，我们在使用 BPLS 抗性平板的同时，增加了 XLD平板（图 3）。利用大部分沙门菌在XLD平板上有黑芯，而疫苗株在 XLD平板上没有黑芯的特点来区分疫苗株和野生株，并且还可根据菌株在 BPLS抗性平板和 XLD平板上的生长特点来区分疫苗株与奇异变形杆菌等其他杂菌。除此之外，我们还发现疫苗株在有氧和无氧条件下三糖铁试验的结果有别于其他菌株，主要表现为无论在有氧还是无氧条件下，疫苗株都不会产气，并且有氧时产生少量黑色沉淀，无氧时不产生黑色沉淀，此特点也可以用来区分疫苗株与其他菌株。通过 BPLS抗性平板和 XLD平板的生长特点区分后，再经过三糖铁试验筛选，最终通过 2次试验筛选出的与疫苗株生长特点和三糖铁试验结果一致的菌株即为可疑疫苗株。最后再利用疫苗株对萘啶酸敏感和能够与 O:9 单因子血清产生凝集反应的特点进行确证试验，通过确证试验的可疑菌株则为疫苗株（图 3）。综上所述，本试验优化了肠炎沙门菌疫苗21-养禽与禽病防治2022 年第 8 期图 3优化后的疫苗株分离鉴定流程株 Sm24/Rif12/Ssq 的分离鉴定方法，新方法依次通过生长特点区分、三糖铁试验和确证试验区分疫苗株和其他菌株，更加精准，能够有效从泄殖腔拭子等样本中分离鉴定出疫苗株。参考文献1Pouillot R,Garin B,Ravaonindrina N,etal.Ariskassessmentofcampylobacteriosisandsalmonellosis linked to chicken meals prepared inhouseholds in da