橙皮苷、柚皮苷与酪蛋白相互作用机制比较分析_刘雪梅.pdf

162 2023,Vol.44,No.04 食品科学 食品化学橙皮苷、柚皮苷与酪蛋白相互作用机制比较分析刘雪梅，王华敏，赵 利，白春清*（江西科技师范大学生命科学学院，江西 南昌 330013）摘 要：采用荧光光谱、同步荧光光谱结合热力学参数分析及分子对接比较研究酪蛋白（casein，CA）与橙皮苷（hesperidin，HES）及柚皮苷（naringin，NAR）之间的相互作用及机制，结果表明：两种多酚对CA的猝灭均为静态猝灭，但HES对CA的荧光猝灭效果及结合亲和力较强，且CA与HES的结合位点数较多。热力学参数证明CA与HES、NAR的结合均为以疏水作用力为主的自发反应。同步荧光光谱显示，两种多酚的加入引起了CA氨基酸内部疏水环境的改变。分子对接进一步证实，两种多酚与CA的结合主要以疏水作用力为主，但HES与CA间存在更多的氢键作用，并使HES与CA之间结合得更为稳定。本研究可为多酚与蛋白质间的相互作用研究以及CA作为黄酮类多酚载体的可行性提供参考依据。关键词：荧光光谱；橙皮苷；柚皮苷；酪蛋白；分子对接 Comparative Studies on Interaction Mechanism of Hesperidin and Naringin with CaseinLIU Xuemei,WANG Huamin,ZHAO Li,BAI Chunqing*(College of Life Sciences,Jiangxi Normal University of Science and Technology,Nanchang 330013,China)Abstract:The interaction and mechanism of casein(CA)with hesperidin(HES)and naringin(NAR)were investigated using fluorescence spectroscopy,synchronous fluorescence spectroscopy,thermodynamic analysis,and molecular docking in this study.The results showed that both polyphenols quenched CA in a static manner,but HES had stronger fluorescence quenching effect and binding affinity to CA and had more binding sites.According to thermodynamic parameters,the binding of CA to HES and NAR was spontaneous and mainly driven by hydrophobic forces.According to synchronous fluorescence spectra,introduction of the two polyphenols caused changes in the hydrophobic environment of amino acid residues in CA.The binding process was mostly driven by hydrophobic forces according to molecular docking,and more hydrogen bonds were formed between HES and CA,making the binding between them more stable.The results of this study can be used as a reference for future studies on polyphenol-protein interactions as well as the feasibility of CA as a carrier of flavonoid polyphenols.Keywords:fluorescence spectroscopy;hesperidin;naringin;casein;molecular dockingDOI:10.7506/spkx1002-6630-20211205-056中图分类号：TS254.9 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2023）04-0162-09引文格式：刘雪梅,王华敏,赵利,等.橙皮苷、柚皮苷与酪蛋白相互作用机制比较分析J.食品科学,2023,44(4):162-170.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20211205-056.http:/ LIU Xuemei,WANG Huamin,ZHAO Li,et al.Comparative studies on interaction mechanism of hesperidin and naringin with caseinJ.Food Science,2023,44(4):162-170.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20211205-056.http:/收稿日期：2021-12-05基金项目：江西省教育厅一般项目（GJJ201114）；江西省现代农业产业技术体系建设专项（赣财文指201813号）；江西科技师范大学青年拔尖人才项目（2020QNBJRC006）；江西省水产品加工及安全控制工程研究中心开放基金项目（KFJJ2101；KFJJ2102）第一作者简介：刘雪梅（1995）（ORCID:0000-0001-8103-4584），女，硕士研究生，研究方向为功能性材料开发。E-mail:*通信作者简介：白春清（1984）（ORCID:0000-0002-2429-0562），女，副教授，博士，研究方向为功能性食品开发。E-mail:食品化学 食品科学 2023,Vol.44,No.04 163近年来，多酚类化合物因广泛的生物活性备受关注，橙皮苷（hesperidin，HES）、柚皮苷（naringin，NAR）是柑橘类黄酮多酚的典型代表。HES是橙皮素与芸香糖形成的糖苷，多来源于橘子、橙子和柠檬等柑橘类水果中，其分子式为C28H34O15；而NAR存在于葡萄柚、橘、橙的果皮和果肉中，两者结构相似（图1），均有8 个酚羟基，但NAR在C-4位置有一个羟基，而HES在C-4位置是一个甲氧基，在C-5位置有一个羟基。两者因具有抗炎1、抗肿瘤2-3、清除自由基1,4及减低血管脆性5等多种生理功能，目前多应用于饲料、食品、医药等领域，其中HES被研究者们认定为一种有前景的预防和治疗新冠肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）感染的药物6。因此，HES、NAR的生物活性研究、改性研究以及药理研究成为近年来研究的热点。然而，HES、NAR水溶性和吸收性较差，导致其生物利用度较低。采用递送载体进行包埋，已被证实是改善功能因子水溶性、提高稳定性及生物利用度的有效方法，而适宜载体的开发对解决HES、NAR上述缺陷具有重要意义。HOHOHOHOHOHOOHOHOHOHOHOHNARHESOHOHOHOH651234OOOOOOOOOOOOOCH3CH3CH3345612图 1 HES、NAR结构式Fig.1 Structural formulae of HES and NARCA是哺乳动物奶中的主要蛋白质之一，作为一种公认的安全蛋白质，由于营养价值丰富，还具有优良的表面活性、稳定性、乳化性和自组装性能等功能特性，在食品工业中被广泛应用。有研究发现CA可与离子、小分子、大分子结合并形成复合物，被认为是生物活性物质的天然载体，可包埋和保护小分子功能因子，以促进功能因子更好吸收和释放，提高其在水中的溶解度和化学稳定性，因此，CA在功能因子、药物新型传递系统中得到了越来越多的应用7-8。有研究表明CA可与蓝莓花青素产生相互作用并结合，蓝莓花青素被包裹于蛋白质中，可提高蓝莓花青素的稳定性及抗氧化能力 9；程昊10发现CA作为载体包埋白藜芦醇后能够提高顺、反式-白藜芦醇的贮藏稳定性。因此，采用CA对NAR、HES进行包埋，可解决NAR、HES的上述缺陷。蛋白质自组装包埋多酚的过程与蛋白质-多酚间的相互作用密切相关，并对载体稳定性、包埋物的释放等起着决定性作用11。目前，CA与多种多酚类物质如茶多酚12、木糖醇13、花青素14间的相互作用已有报道；HES、NAR与蛋白质的相互作用也有相关研究，如：刘蓉15发现NAR诱导的牛血红蛋白的荧光猝灭机制是一个静态猝灭过程且两者间的结合仅有一个结合位点；也有研究表明HES与牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）间的相互作用为单一的动态猝灭过程，且主要靠疏水作用力结合16。然而，国内外对HES、NAR与CA之间的相互作用研究较少，其作用机制尚不清楚，CA作为HES、NAR载体的可行性有待验证。因此，探究CA与HES、NAR的相互作用及其机制，对HES、NAR递送载体的开发具有重要意义。有研究表明，荧光光谱是研究分子间相互作用的有效方法，通过对荧光数据的分析结合同步荧光光谱、热力学参数分析可获得小分子与蛋白质间的相互作用方式、作用位点及结合力类型等有效信息。分子对接则可利用计算机模拟可视化技术实现受体与配体空间结构的匹配，通过对分子对接结果的分析，计算出多酚与蛋白质之间的相互作用力、相互作用力距离、相互作用官能团及结合位点等，从理论上分析相互作用的可行性以及相互作用机制11。综上，本研究拟综合采用荧光光谱、同步荧光光谱结合热力学参数分析及分子对接比较研究CA与HES及NAR之间的相互作用及机制，以期为黄酮类多酚与蛋白质间的相互作用研究以及CA作为HES及NAR载体的应用提供参考依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂酪蛋白（casein，CA）美国Sigma公司；HES（纯度95%）、NAR（纯度95%）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他试剂均为分析纯。1.2 仪器与设备F-2700荧光分光光度计 深圳市谱赛斯科技有限 公司；85-2恒温磁力搅拌机 上海向帆仪器有限公司；PHS-25型酸度计 上海仪电科学仪器股份有限公司；激光粒度分析仪 英国Malvern公司；U-T6A紫外-可见分光光度计 屹谱仪器制造有限公司。1.3 方法1.3.1 溶液配制配制pH 7.4 10 mmol/L的磷酸缓冲盐溶液，并以此为溶剂配制1 mg/mL的CA储备液，4 保存备用；HES或NAR使用去离子水溶解，并使用0.1 mol/L的NaOH溶液将pH值调至12，配制成浓度为1 mmol/L的HES及NAR溶液作为储备液，4 保存备用。1.3.2 多酚与CA相互作用的荧光光谱将CA质量浓度固定在0.8 mg/mL，滴加HES或NAR储备液至多酚浓度为09.68106 mol/L，于不同温度164 2023,Vol.44,No.04 食品科学 食品化学下（298、304、310 K）充分振荡混合1 h后，移入石英比色皿中，在激发波长为280 nm、激发和发射狭缝宽度为5 nm条件下进行扫描，记录发射波长为300500 nm的荧光光谱。以不含多酚的CA作为空白对照，扫描荧 光强度。为探究CA分别与HES、NAR的相互作用机制，采用Stern-Volmer方程对荧光光谱测定数据进行了拟合，并基于相关参数的分析对荧光猝灭类型进行判断。Stern-Volmer方程如下：=1+KQ0Q=1+KSVQFF0（1）式中：F0为未加入多酚时CA的荧光发射强度；F为含多酚时CA的荧光发射强度；KQ为双分子猝灭过程速率常数/（kJ/（molK）；Q为多酚浓度/（mol/L）；KSV为Stern-