川芎嗪对顺铂耳毒性大鼠耳蜗...1信号通路相关蛋白表达影响_金婧.pdf

28第25 卷 第 2 期 2023 年 2 月辽 宁 中 医 药 大 学 学 报JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCMVol.25 No.2 Feb.，2023川芎嗪对顺铂耳毒性大鼠耳蜗组织Nrf2/NQO1信号通路相关蛋白表达影响金婧1，马贤德1，舒福1，张琦2，曲中源2，马梽轩2，冷辉1，2，石磊1，2（1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847；2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032）基金项目：辽宁省自然基金项目（2019-ZD-0952）；国家中医药管理局第五批全国中医临床优秀人才研修项目（国中医药人教函 2022 1号）；辽宁省第一批优秀中医临床人才培养项目（辽卫办发 2022 29号）作者简介：金婧（1997-），女，辽宁大连人，硕士在读，研究方向：内耳疾病的基础与临床研究。通讯作者：石磊（1978-），男，辽宁丹东人，教授、主任医师，博士，研究方向：耳鼻咽喉科疾病。摘要：目的 探讨川芎嗪（即四甲基吡嗪，tetramethylpyrazine，TMP）对顺铂耳毒性大鼠的作用机制，以及血清中谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）含量变化、耳蜗组织中肌腱膜纤维肉瘤癌基因（musculoaponeurotic fibrosarcoma，Maf）、血红素氧合酶1（HO-1）和还原型辅酶/醌氧化还原酶（NQO1）蛋白表达对其的影响。方法 采用腹腔注射顺铂（4 mg/kg）诱导顺铂耳毒性大鼠模型。将大鼠随机分为空白对照组、空白+TMP组、模型对照组（M组）、模型 TMP组。通过比较大鼠听性脑干反应（auditory brainstem response，ABR）听力阈值的变化、基底膜铺片技术观察内耳毛细胞纤毛形态变化（硝酸银染色），评估TMP对顺铂耳毒性大鼠耳蜗毛细胞结构的影响。比色法测定大鼠血清中GSH-Px含量变化。Western blot检测法检测各组大鼠耳蜗组织中Maf、HO-1和NQO1的表达变化。结果 与空白组相比，模型组大鼠血清中抗氧化酶GSH-Px活性显著下降（P0.05），耳蜗组织中Maf、NQO1和HO-1基因表达均呈上升趋势；与模型对照组比较，模型+TMP组能够显著提高药物性耳聋大鼠血清中抗氧化酶GSH-Px（P0.05）活性，增加耳蜗组织中Maf，NQO1和HO-1的蛋白的相对表达（P0.05）。结论 TMP对药物性耳聋大鼠病理损伤具有恢复作用，其机制可能与血清中GSH-Px含量变化和Nrf2/NQO1信号通路相关蛋白的表达有关。关键词：川芎嗪；氧化应激；药物性耳聋；Nrf2/NQO1中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1673-842X (2023)02-0028-05Effect of Ligustrazine on the Expression of Nrf2/NQO1 Signal Pathway Related Proteins in the Cochlea of Cisplatin Ototoxic RatsJIN Jing1，MA Xiande1，SHU Fu1，ZHANG Qi2，QU Zhongyuan2，MA Zhixuan2，LENG Hui1，2，SHI Lei1，2（1.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，Liaoning，China；2.Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，Liaoning，China）Abstract：Objective To investigate the mechanism of tetramethylpyrazine（TMP）on cisplatin ototoxicity in rats，and the changes of glutathione peroxidase（GSH-Px）in serum，musculo aponeurotic fibrosarcoma oncogene（Maf）in cochlea，effects of heme oxygenase-1（HO-1）and reduced coenzyme/quinone oxidoreductase（NQO1）protein expression on them.Methods The rat model of cisplatin ototoxicity was induced by intraperitoneal injection of cisplatin（4 mg/kg）.The rats were randomly divided into blank control group，blank+TMP group，model control group and model+TMP group.The effect of TMP on the structure of cochlear hair cells in cisplatin ototoxic rats was evaluated by comparing the changes of auditory brainstem response（ABR）hearing threshold and the changes of cilia morphology of inner ear hair cells（silver nitrate staining）.The content of GSH-Px in rat serum was measured by colorimetry.The expressions of Maf，HO-1 and NQO1 in the cochlea of rats in each group were detected by Western blot.Results Compared with the blank group，the activity of antioxidant enzyme GSH-Px in serum of model group decreased significantly（P0.01），and the expression of Maf，NQO1 and HO-1 genes in cochlea increased；Compared with model control group，model+TMP group could significantly increase the activity of serum antioxidant enzyme GSH-Px（P0.01）and the relative expression of Maf，NQO1 and HO-1 proteins in cochlea（P0.05）.Conclusion TMP can restore the pathological injury of drug-induced deafness rats，and its mechanism may be related to the change of GSH-Px content in serum and the expression of Nrf2/NQO1 signal pathway related proteins.Keywords：Ligustrazine；oxidative stress；drug induced deafness；Nrf2/NQO1顺铂对增殖肿瘤细胞的细胞毒性作用是通过铂化DNA化合物抑制DNA复制和转录，进而阻断细胞周期，选择性地诱导肿瘤细胞的凋亡和自噬来实现的1。其高效的抗癌性在临床上被普遍应用于各类实体瘤的化疗或者联合化疗方案中2。耳毒性是顺铂常见的不良反应，其发病机制与内耳细胞氧化损伤异常有一定关系3，即通过细胞内活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）在内耳的过量产生DOI：10.13194/j.issn.1673-842x.2023.02.00729 25 卷 辽宁中医药大学学报 和积累，导致毛细胞、螺旋神经节和血管纹边缘细胞的损伤，从而造成延迟性、进展性、不可逆性的感音神经性听力损失4。因此寻找有效的干预目标及靶标分子来预防或降低顺铂的耳毒性，对于提高化疗患者的生存率至关重要。核因子红系2相关因子（nuclear factorery throid 2-related factor，Nrf2）作为细胞的主要防御机制和细胞存活的主要调节因子5，可以防止代谢、异生物和氧化应激导致的细胞过度损伤。当细胞受到氧化应激刺激时，Keap1中-SH基团的修饰或Nrf2的磷酸化促进细胞质中的Keap1/Nrf2解除耦合状态6，使Nrf2移位至细胞核，与其伴侣sMAF形成异源二聚体，与ARE（抗氧化反应元件）序列结合，激活下游相关的基因转录7，保护细胞免受各种毒性暴露所造成的氧化应激引起的组织损伤。目前TMP治疗顺铂耳毒性的机制虽有一定的报道8-9，但是否与Nrf2/NQO1信号通路的抗氧化应激作用相关尚未完全阐明。本实验从Nrf2/NQO1信号通路的抗氧化应激的角度探讨顺铂耳毒性的作用机制，希冀研究结果可进一步阐明TMP治疗顺铂耳毒性的抗氧化应激作用以及探讨顺铂耳毒性大鼠的中药防治。1材料1.1 动物健 康Wistar雄 性 大 鼠80只，SPF级，体 质 量（22020）g，购买于辽宁长生生物技术股份有限公司，实验动物许可证号：SCXK（辽）2020-0001。饲养环境为SPF级屏障环境，温度（221），相对湿度45%50%，12 h明暗循环，换风次数1520次/h，自由进食消毒后的饲料和饮用水，每日更换垫料。环境噪声小于40 dB（A）。该实验由辽宁中医药大学实验动物伦理委员会审核批准，伦理编号为21000042020049。实验结束后，经腹腔注射10%水合氯醛（450 mg/kg）麻醉后处死大鼠。1.2 药物与试剂盐酸川芎嗪（平光制药股份有限公司，批号：H20031302）；顺 铂（齐 鲁 制 药 有 限 公 司，批 号：H20023460）；GSH-Px检测试剂盒，购自南京建成生物工程研究所有限公司，货号：A005-1-2；Anti-c-Maf抗体，购自abcam公司，（货号：ab77071）；重组Anti-Heme Oxygenase 1抗 体EPR1390Y，购 自abcam公司，（货号：ab68477）；重组Anti-NQO1抗体（EPR3309），购自abcam公司，（货号：ab80588）。1.3 仪器高速冷冻离心机，型号：Biofuge Primo R；厂家：美国科峻（德国）。高速匀浆机，型号：FS-1；厂家：江苏金坛市环宇科学仪器。电泳仪，型号：EPS300；厂家：上海天能科技有限公司。垂直电泳槽，型号：VE-180；厂家：上海天能科技有限公司。转印槽，型号：VE-386；厂家：上海天能科技有限公司。凝胶成像分析系统，型号：Tanon-4200SF；厂家：上海天能科技有限公司。冰箱，型号：BCD-208F；厂家：上海天能科技有限公司。恒温水浴锅，型号：SHA-B；厂家：常州国华电器有限公司。2方法2.1 实验动物分组与给药80只大鼠适应性饲养1周，随机数字表法分为空白组（30只）和模型组（50只）。模型组腹腔注射顺铂诱导药物性耳聋模型，给药剂量为4 mgkg-1 d-1，连续给药5 d，末次给药后进行模型评价。空白组腹腔注射等量的生理盐水正常饲养。模型复制成功后再次将空白组及模型组大鼠随机分为两组：即空白对照组（15只）、空白+TMP组（15只）、模型对照组（25只）、模型+TMP组（25