尺寸可控的球型DNA纳米颗粒构筑策略及其应用_成佳峰.pdf

第54卷 第 3 期2023 年 3 月高分子学报ACTA POLYMERICA SINICAVol.54,No.3Mar.,2023尺寸可控的球型DNA纳米颗粒构筑策略及其应用*成佳峰1,2 袁 伟2,3 丁雨樵1 魏旭南1 郁志勇1*徐立进1*董原辰2,3*(1中国人民大学化学系 北京 100872)(2中国科学院化学研究所 北京 100190)(3中国科学院大学 北京 100049)摘要为探究球型DNA纳米颗粒的尺寸对细胞摄取的影响，提出了一种新型构筑策略，制备了一系列尺寸精准可控的球型DNA纳米颗粒，并进一步揭示了球型DNA纳米颗粒的尺寸与MCF-7细胞内化效率的关系；此外，该策略还可以与框架诱导策略相结合，构筑尺寸可控的磷脂囊泡.该结果为构建新型高效的DNA纳米颗粒载药系统提供了理论参考，为特定尺寸的药物载体设计和开发拓展了思路.关键词尺寸可控，球型DNA纳米颗粒，DNA自组装，框架诱导组装球型DNA纳米颗粒是由一层致密的核酸外壳和内核结构组成的纳米材料1，内核通常由纳米金颗粒2,3、四氧化三铁纳米颗粒4、脂质体5和蛋白6等材料构成.自球型DNA纳米颗粒被提出以来，由于其可编程、散射、催化等优异的理化性质7，被广泛用于材料设计8、生物探针9,10和构建DNA纳米晶体1113等领域.近年来研究发现，由于外层修饰了致密的核酸分子，球型DNA纳米颗粒可以在无转染剂的情况下被细胞摄取14，为发展新型核酸1,15,16、药物1719和蛋白质6的递送载体提供了新工具.随着纳米科学的快速发展，研究表明纳米颗粒的尺寸会影响细胞摄取的效率2023，因此，揭示球型DNA纳米颗粒细胞内化效率对纳米颗粒的设计、提高药物递送效率和防癌抗癌等研究具有重要意义24.然而，受限于缺乏构建尺寸可控的球型DNA纳米颗粒的方法，相关研究仍鲜有报道.目前报道的调节球型DNA纳米颗粒尺寸的方法主要包括调控内核尺寸25和外围 DNA 长度26.调控内核的方法可以充分利用内核结构的多样性实现大尺度调控，但是受体系差异的限制，调控策略较为复杂.同时随着内核尺寸的增加，DNA在纳米颗粒表面的覆盖率会逐渐降低，不利于DNA纳米颗粒稳定性27的保持.通过调节外围修饰的 DNA 长度的策略，仅通过调整DNA的碱基数目便可精准调控纳米颗粒的尺寸.但受制于DNA合成与修饰技术，商业化的DNA单链长度有限，制约了该策略的有效调控范围.近年来，DNA树突状分子因其结构规整、分子量与尺寸可控的特点而受到越来越多科研工作者的关注2833.利用DNA树状分子制备可控大小的球型DNA纳米颗粒策略也被报道，例如科研工作者以具有黏性末端的刚性树状分子同时作为内核和组装基元，并结合DNA碱基互补作用实现逐代组装，成功构筑了尺寸精准可控的DNA纳米球26,33.然而该策略所采用的内核尺寸小、结合位点少，构建的球型DNA纳米颗粒尺寸范围分布较窄，限制了其在揭示细胞内化效率尺寸效应中的应用.因此，发展新型构建尺寸可控的球型DNA纳米颗粒策略仍是该领域研究的 研究论文*2022-09-23收稿，2022-10-21录用，2022-11-16网络出版；中国科学院化学研究所人才基金(基金号 C220200704/1)、北京市自然科学基金(基金号 Z180016)和国家自然科学基金(基金号 21971248)资助项目.*通讯联系人，E-mail:Y;;本文附有电子支持材料，与正文一并刊登在本刊网站http:/www.gfzxb.orgdoi:10.11777/j.issn1000-3304.2022.223233363期成佳峰等：尺寸可控的球型DNA纳米颗粒构筑策略及其应用研究重点.在本工作中，如图1所示，以DNA单链修饰的金纳米颗粒(AuNP-G0)作为“内核”，有效提高了起始结合位点密度，以结构均一的刚性DNA树突状分子为组装基元，通过双链互补逐代组装，成功构筑了一系列尺寸可控的DNA纳米颗粒(AuNP-Gx).进一步地，将制备得到的AuNP-Gx核酸纳米颗粒成功应用于揭示核酸纳米颗粒尺寸对细胞摄取效率的影响，并与框架诱导组装策略结合3436，构建了新型尺寸可控的磷脂囊泡.1实验部分1.1实验试剂硫酸铜和二甲基亚砜(DMSO)等购自北京通广精细化工公司.抗坏血酸钠、氯金酸、柠檬酸钠和 THTA 等购自北京百灵威科技有限公司.BSPP、OG和Stains All等购于Sigma-Alrdich(上海)贸易有限公司，DOPC、DOPG、PE-PEG 2000购于Avanti Lipid，Hoechst购于北京碧云天生物技术有限公司.叠氮修饰mpHLIP多肽购自合肥科生景肽生物科技有限公司.本实验所有巯基修饰DNA、炔基修饰DNA、Cy5荧光修饰DNA链购自上海生工生物公司(HPLC纯化).三纯水均产自于纯水仪Millipore净化系统(18.2 Mcm).1.2尺寸可控的DNA金纳米颗粒(AuNP-Gx)的制备AuNP-G1：将纯化好的DNA修饰的金纳米颗粒(AuNP-G0)与组装体Y1在10 mmol/L磷酸盐缓 冲 液(1PBS，pH=7.4)中 混 合(AuNP-G0与Y1的摩尔比为 1:300)，溶液的金纳米浓度为120 nmol/L，放置5 h后，用1PBS溶液进行离心洗涤纯化.AuNP-G2到AuNP-G4的制备方法也与AuNP-G1基本相同，仅改变混合时纳米颗粒和Y的摩尔比，其中AuNP-G2是将AuNP-G1与Y2以1:600摩尔比混合，AuNP-G3是将AuNP-G2与Y1以1:1200摩尔比混合，AuNP-G4是将AuNP-G3与Y2以1:2400摩尔比混合.1.3纳米颗粒的细胞内吞内吞实验1.3.1共聚焦激光扫描显微镜成像将MCF-7细胞接种至黑色96孔板，每孔约1104个细胞，在37、5 vol%CO2条件下孵育18 h，使细胞贴壁完全.向每个孔中加入纳米颗粒(AuNP-G1、AuNP-G1-Cy5、FGA-AuNP-G1-Cy5)，使纳米颗粒终浓度为0.65 nmol/L，孵育4 h后吸去培养基，加入100 L含有0.75 g/mL Hoechst 33342的1PBS溶液进行细胞核染色.染色15 min后用1PBS溶液小心洗涤3次后，用激光共聚焦显微镜对细胞样品进行成像表征.Hoechst 33342：激发波长为 405 nm，采集范围为425475 nm；Cy5荧光基团的激发波长为633 nm，采集范围为660710 nm.1.3.2细胞流式实验在24孔板中接种上MCF-7细胞，每孔种的Y1Y2HSAuNPNucleusFig.1 DNA nanoparticles with controllable sizes(AuNP-Gx)were successfully prepared and applied to reveal size-dependent cell uptake efficiency.337高分子学报2023年细胞数约为1104个，在5%CO2、37 条件下培养18 h，待细胞完全贴壁后，加入纳米颗粒，使纳米颗粒终浓度都保持为0.65 nmol/L，孵育4 h后吸出培养基，并且用1PBS溶液小心洗涤3次后，用TrypLE胰酶消化后用1PBS缓冲液冲洗至EP管，利用流式细胞仪采集细胞荧光.1.3.3纳米颗粒的细胞内化效率实验荧光法将96孔板分为3组：控制组、实验组和阴性对照组.将数目约为1104个的MCF-7细胞接种至实验组和阴性对照组的孔中，控制组仅加入100 L 1PBS，在5%CO2、37 条件下培养18 h后，加入相同浓度的不同代数的纳米颗粒分别加入控制组和实验组的孔中(阴性对照组不加)，孵育4 h后除去对实验组和阴性对照组的培养基，用1PBS溶液小心洗涤3次后加入20 L的裂解液用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触，5 s后补加80 L 1PBS溶液振荡2 min后，静置10 min，在酶标仪上检测Cy5荧光强度.实验组的荧光值减去阴性对照组的荧光值记为Fi，控制组的荧光值记为F0.通过计算得出不同代数纳米颗粒的细胞内化效率.AuNP-Gx纳米颗粒的内化效率计算公式：I=(Fi/F0)1.3.4纳米颗粒细胞内吞效率实验-电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法将5104个的MCF-7细胞接种至24孔板中，在5%CO2、37 条件下培养18 h，使细胞贴壁.之后小心移除培养液，加入0.3 mL含有AuNP-Gx(10 nmol/L)的细胞培养液，在37，5 vol%CO2条件下孵育4 h.孵育结束后，小心吸除培养液后，用300 L 1PBS洗去未被细胞内化的AuNP-Gx纳米颗粒，加入100 L TrypLE胰酶消化后放入培养箱5 min后用200 L的1PBS将细胞冲洗至悬浮，之后将细胞收集至 EP 管，并以 11908 r/min离心10 min后，在EP管底部得用于过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)定量测试的金纳米小丸.通过ICP-MS测试，得到每组细胞内的金元素的总质量计为mAu.为了得到每个细胞吸收的纳米颗粒的数量，纳米颗粒的数量必须根据样品中发现的金元素的总质量进行计算.通过对金的相对原子质量和13 nm金颗粒的直径来计算得到每个13 nm金颗粒具有6.78104个金原子.将样品中的金原子的总数量除以6.78104后再除以细胞数便可确定每个细胞中AuNP-Gx纳米颗粒的数量.1.4炔基DNA和叠氮多肽的点击反应用DMSO溶解叠氮修饰mpHLIP多肽至多肽终浓度为5 mmol/L的母液.将炔基DNA溶于纯水中，浓度定至 1 mmol/L.将 DMSO，浓度为5 mmol/L的多肽母液、1 mmol/L的炔基DNA溶液、200 mmol/L的THTA、100 mmol/L的硫酸铜溶液、1 mol/L的抗坏血酸钠按体积比为60:50:60:1:1:1按顺序依次混合后序置于金属浴在60 加热3 h.所得产物利用20 wt%PAGE进行割胶纯化，最终DNA-多肽(D-P)产物利用20 wt%PAGE和MALDI-TOF进行确认.1.5AuNP-Gx纳米颗粒的框架诱导组装(FGA)1.5.1AuNP-Gx的多肽框架制备将10 L 50 nmol/L AuNP-G0、0.6 L 250 nmol/L DNA多肽(D0-P)、9 L10PBS、50 L 10 wt%表面活性剂辛基-D-吡喃葡萄糖苷(OG)和30.4 L三纯水混合，在室温下杂交2 h得到由OG分散的多肽框架.然后用5 wt%OG的1PBS溶液对多肽框架进行离心洗涤，去除未互补的DNA多肽后得到AuNP-G0的多肽框架.AuNP-G1和AuNP-G2的多肽框架制备过程中所需的DNA多肽用量分别为AuNP-G0的2倍和4 倍(0.6 L 500 nmol/L D1-P、0.6 L 1 mmol/L D2-P)，其余合成步骤完全相同.1.5.2多肽框架的透析磷脂诱导在100 L 5 nmol/L AuNP-G0的多肽框架的加入 1.5 L 30 mmol/L Lipid(81 mol%DOPC，15 mol%DOPG，4 mol%PE-2000-PEG)并在室温下轻微震荡1 h后，将样品转移至7k MWCO的透析盒中，在2 L 1PBS缓冲液中进行室温透析12 h后，更换等体积的1PBS缓冲液再次透析12 h后得到异质脂质体(FGA-AuNP-G0).AuNP-G1和AuNP-G2肽框架的透析诱导方法和AuNP-G0肽框架的诱导方法基本一致，仅改变 30 mmol/L Lipid的用量分别为1.67和3.33 L.2结果与讨论2.1尺寸可控的DNA金纳米颗粒(AuNP-Gx)的制备如图2(a)所示，通过逐步组装的方式制备了尺寸可控的DNA金纳米颗粒.利用巯基DNA单3383期成佳峰等：尺寸可控的球型DNA纳米颗粒构筑策略及其应用链(D-SH)对13 nm直径的金纳米进行修饰，首先得到DNA功能化的金纳米颗粒(AuNP-G0)(见电子支持信息S1).同时，设计了三臂的DNA树状分子单