传染性法氏囊病病毒疫苗株B...胞和Vero细胞感染性研究_潘鹏宇.pdf

动物医学进展,2 0 2 3,4 4(2):4 1-4 5P r o g r e s s i nV e t e r i n a r yM e d i c i n e传染性法氏囊病病毒疫苗株B 8 7在D F-1细胞和V e r o细胞感染性研究 收稿日期:2 0 2 2-0 3-0 2 基金项目:天津市教委科研计划项目(2 0 2 1 K J 1 0 8);天津市企业科技特派员项目(2 2 Y D T P J C 0 0 9 9 0);国家自然科学基金项目(3 1 7 0 2 2 2 3);天津市“1 3 1”创新型人才团队建设项目(2 0 1 8 0 3 1 8)作者简介:潘鹏宇(1 9 9 6-),女(满族),山东武城人,硕士研究生,主要从事畜禽病毒与免疫研究。*通讯作者潘鹏宇1,韩金泽1,殷建豪1,谢艾伶1,吴凤明2,刘鼎阔3,孙英峰1,尤春雪1,于晓雪1*,李留安1*(1.天津农学院动物医学与动物科学学院 天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室,天津3 0 0 3 9 2;2.天津市广源畜禽养殖有限公司,天津3 0 1 8 0 6;3.鼎正新兴生物技(天津)有限公司 天津市生物饲料添加剂企业重点实验室,天津3 0 0 3 8 3)摘 要:为比较传染性法氏囊病病毒(I n f e c t i o u sb u r s a l d i s e a s ev i r u s,I B D V)疫苗株B 8 7对D F-1细胞和V e r o细胞易感性,对比了I B D VB 8 7株感染两种细胞后的致细胞病变效应(c y t o p a t h i ce f f e c t,C P E)、病毒基因组d s R NA、半数组织感染量(m e d i a nt i s s u ec u l t u r e i n f e c t i v ed o s e,T C I D5 0)水平、病毒载量及V P2基因表达水平。结果显示,I B D VB 8 7株感染后,D F-1细胞C P E程度高于V e r o细胞;D F-1细胞病毒基因d s R NA荧光密度 高 于V e r o细 胞;D F-1细 胞 病 毒 载 量 荧 光 密 度 高 于V e r o细 胞,且D F-1细 胞 中 病 毒 滴 度(1 05.4 2 30.0 3 2 9 6T C I D5 0/0.1m L)极显著高于V e r o细胞中病毒滴度(1 02.5 9 20.0 3 4 2 8T C I D5 0/0.1 m L,P0.0 1),V P2基因表达量显著高于V e r o细胞(P0.0 5)。说明I B D VB 8 7株对D F-1细胞的感染性高于V e r o细胞。关键词:鸡传染性法氏囊病病毒B 8 7株;D F-1细胞;V e r o细胞;感染性;细胞嗜性中图分类号:S 8 5 2.6 5 9.4文献标识码:A文章编号:1 0 0 7-5 0 3 8(2 0 2 3)0 2-0 0 4 1-0 5 鸡传染性法氏囊病(I n f e c t i o u sb u r s a ld i s e a s e,I B D)是由I B D V引起的高度传染性的免疫抑制性疾病1,2。该病使3周龄1 2周龄雏鸡法氏囊萎缩甚至坏死,鸡只严重免疫抑制或死亡,对世界养禽业造成威胁。疫苗接种是预防该病的最有效措施。B 8 7株I B D V是我国广泛使用的I B D V疫苗株,该疫苗通过接种S P F鸡胚,收获感染鸡胚,经研磨、添加适宜稳定剂、冷冻真空干燥等步骤制备,但生产工艺繁杂,成本较高。D F-1细胞和V e r o细胞是能无限繁殖的细胞系,广泛应用于多种病毒增殖、重组蛋白表达、动物与人类病毒病疫苗生产等领域。本试验使用I B D VB 8 7株感染D F-1细胞和V e r o细胞,利用免疫荧光法、实时荧光定量P C R等比较两种细胞对病毒的易感性,旨在为I B D疫苗规模化生产筛选合适细胞系奠定基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 细胞系与毒株 D F-1细胞和V e r o细胞,保存于天津 农学院兽医 学实验 室;I B D V活 疫 苗 株B 8 7,青岛易邦生物工程有限公司产品。1.1.2 主要试剂 R NA p r e pp u r e总R NA提取试剂盒,天根生化科技(北京)有限公司产品;DMEM培养基,赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品;青链霉素混合液、1P B S缓冲液、D A P I溶液,北京索莱宝 科 技 有 限 公 司 产 品;B o v i n eS e r u m A l b u m i n、F I T C标记山羊抗鸡l g Y,西格玛集团有限公司产品;A l l-i n-O n eTMF i r s t-S t a n dc D NAS y n t h e s i sK i t,美国G e n e C o p o e i a(中国)广州复能基因有限公司产品;A n t i-d s R NA mA bS C I C ON SJ 2(I g G 2 a),北京康为世纪生物科技有限公司产品;F I T C标记山羊抗小鼠I g G(H+L),上海碧云天生物技术有限公司产品;抗I B D V鸡血清,保存于天津农学院兽医学试验室。1.1.3 主要仪器 实时荧光定量P C R仪,伯乐生命医学产品(上海)有限公司产品;温度梯度定量P C R仪,美国艾尔特公司(A L T)产品;超微量分光光度计,香港基因有限公司产品;正置倒置一体荧光显微镜,美国E c h o L a b o r a t o r i e s公司产品。1.2 方法1.2.1 C P E观察比较 D F-1细胞、V e r o细胞接种至细胞培养板,每种细胞3个重复孔,3 7、体积分数为5%C O2培养箱中培养。待细胞生长至7 0%DOI:10.16437/ki.1007-5038.2023.02.0028 0%后接种I B D V疫苗株B 8 7(MO I=1),2 4h后观察并记录C P E。1.2.2 免疫荧光检测 细胞爬片经无水乙醇超声3 0m i n,高温蒸汽灭菌并烘干后,置2 4孔细胞培养板内,分别接种相同细胞量D F-1细胞和V e r o细胞,细胞生长至7 0%8 0%接种I B D V疫苗株B 8 7,培养2 4h,P B S清洗3次;4 0m g/L多聚甲醛固定3 5m i n,弃固定液,P B S清洗3次;1 m L/L T r i t o nX-1 0 0P B S室温通透7m i n,P B S清洗3次,5 0g/LB S A封闭2h。J 2抗体(d s R NA单克隆抗体,15 0 0稀释)或抗I B D V鸡血清孵育1.5h,P B S清洗2次3次;F I T C标记山羊抗小鼠I g G(H+L)抗体或F I T C标记山羊抗鸡l g Y抗体孵育1h,P B S清洗3次;D A-P I染色液(110 0 0稀释)孵育5m i n,P B S清洗4次;爬片取出后加入抗淬灭性溶剂封片,晾干后荧光显微镜观察。1.2.3 T C I D5 0检测 I B D V疫苗株B 8 7感染D F-1或V e r o细胞(MO I=0.1)2 4h后,反复冻融3次,离心,取上清液测定T C I D5 0。D F-1细胞、V e r o细胞分别接种至9 6孔细胞培养板内,生长至7 0%8 0%后,DM E M维持液(2 0m L/L胎牛血清,1 0m L/L双抗)1 0倍系列稀释待测病毒液,每个稀释度3个重复,取11 0-111 0-88个稀释度病毒液加入9 6孔细胞培养板内,对照组只加维持液1 0 0L/孔,3 7、体积分数为5%C O2培养箱培养4d后进行I F A检测。弃9 6孔板培养液,P B S清洗3次,4 0m g/L多聚甲醛固定,P B S清洗3次,加入抗I B D V鸡血清(15 0 0稀释),2 5L/孔,4过夜;次日,P B S清洗3次,F I T C-标记羊抗鸡l g Y抗体(110 0 0稀释)孵育1h,P B S清洗3次,置荧光显微镜下观察记录阳性孔,R e e d-M u e n c h法计算T C I D5 0。1.2.4 V P2基因表达量检测 参照文献3-4 报道的引物序列合成实时荧光定量P C R引物(表1),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。I B-D VB 8 7株感染D F-1细胞、V e r o细胞2 4h后,P B S清洗2次,加入3 5 0L T r i z o l裂解液,涡旋振荡,1 20 0 0r/m i n离 心2 m i n;取 上 清 加 入 等 量7 0 0m L/L乙醇溶液,1 20 0 0r/m i n离心1m i n;弃上清加入3 5 0L去蛋白液,1 20 0 0r/m i n离心1m i n;弃上清加入8 0LD N a s e I工作液室温静置1 5m i n;加入3 5 0L去蛋白液,1 20 0 0r/m i n离心1 m i n;弃上清,加入5 0 0L漂洗液静置2m i n,1 20 0 0r/m i n离心1m i n;反复操作2次后室温放置晾干,加5 0LR N a s e-F r e ed d H2O。根据反转录试剂盒说明书合成c D NA,置-2 0保存待用。以获得的c D NA为模板进行实时荧光定量P C R检测,1 5LP C R反应体系包括:2A l l-i n-O n eTMq P C RM i x7.5L,上、下游引物各1L,c D NA模板5.5L。反应条件为:9 56 0m i n;9 5 1 5s,5 5 1m i n,共4 0个循环;7 21 5s。表1 引物序列信息T a b l e1 P r i m e r s e q u e n c e i n f o r m a t i o n基因G e n e方向D i r e c t i o n引物序列P r i m e r s e q u e n c eG e n B a n k登记号G e n B a n kr e g i s t r a t i o nc GA P DH3F o r w a r dR e v e r s e5 -C T C T G C C C C C T C T G C T GA T-3 5 -C A G GA G G C A T T G C T GA T GA T C-3 NM-2 0 4 3 0 5B 8 7-V P24F o r w a r dR e v e r s e5 -GAA T T C G C A G C GA T GA C AAA C C T G-3 5 -G T C GA C A G T C A G C T G C C T T A T G C G-3 N C-0 0 4 1 7 8.11.2.5 数据统计 采用s p s s 2 3.0软件独立样本t检验进行数据的差异显著性统计分析,所有数据以“平均值标准误”表示,P0.0 5表示差异显著,P0.0 1表示差异极显著。2 结果2.1 I B D V B 8 7株 感 染D F-1细 胞 和V e r o细 胞C P E程度对比 I B D V B 8 7株分别感染D F-1细胞与V e r o细胞,2 4h后观察C P E,可见未接毒的D F-1细胞与V e r o细胞为成纤维状贴壁,细胞形态为梭形。接毒后,两种细胞均出现细胞病变现象,细胞形态改变,发生皱缩脱落,与D F-1细胞相比,V e r o细胞C P E程度低于D F-1细胞(图1)。2.2 I B D VB 8 7株感染D F-1细胞和V e r o细胞中病毒基因组d s R NA对比 图2和图3显示,D F-1细胞(图2 D图2 F)中绿色荧光强度高于V e r o细胞中(图2 A图2 C)的荧光强度,且差异显著(P0.0 5)。说明D F-1细胞对I B D VB 8 7株易感性强于V e r o细胞,且d s R NA在两种细胞中有相似的细胞质