基于自适应边界检测的荧光免疫层析峰图定位研究.pdf

技术与应用生命科学仪器 2023 第21卷/1期50Abstract:The current fluorescence immunochromatography is less accurate in finding test peak for low concentrations of the substances to be measured.To address this issue,an adaptive boundary detection peak search algorithm based on wavelet transform is proposed.The data is first pre-processed,followed by wavelet decomposition.By changing the decomposition scale and the number of layers,the interference layer coefficients are set to zero and the effective signal is retained.The processed signal is then perform feature extraction,and feature extraction is achieved by local extreme value identification of ridges.Finally,the localization of control(C)peak and test(T)peak is achieved and the peak area is calculated.The experimental results showed that good linearity in the range of 50 to 1000 pg/ml and the linear correlation coefficient was not less than 0.998.The relative standard deviations were 1.23%3.93%.The results show that the proposed adaptive boundary detection algorithm is more capable of identifying weak peaks and improves the accuracy of peak map localization.Key words:Fluorescence immunochromatography,Wavelet transform,Border adaptive,Detection of peaks基于自适应边界检测的荧光免疫层析峰图定位研究范昭阳1，刘新全1,2，胡琛光3，张华4，汪曣1，杜康2*（1.天津大学精密仪器与光电子工程学院，天津 300072；2.天津博硕科技有限公司，天津 300499；3.北京华科泰生物技术有限公司，北京 101100；4.天津医科大学总医院空港医院，天津 3003081）Research on fluorescence immunochromatography peak map localization based on adaptive boundary detectionFAN Zhaoyang1,LIU Xinquan1，2,HU Chenguang3,ZHANG Hua4,WANG Yan1,DU Kang2*(1.School of Precision Instruments and Optoelectronics,Tianjin University,Tianjin 300072;2.Tianjin Boshuo Technology Co.,Ltd,Tianjin 300499;3.Beijing Savant Biotechnology Co.,Ltd.,Beijing 101100;4.Tianjin Medical University General Airport Hospital,Tianjin 300308)摘要：针对目前荧光免疫层析分析仪对低浓度待测物的T峰寻峰准确率较低的问题，提出了一种基于小波变换的自适应边界检测寻峰算法。首先对数据进行预处理，之后进行小波分解，通过改变分解尺度与层数，将干扰层系数置零且保留有效信号，对处理后的信号进行特征提取。特征提取利用局部极大值识别脊线实现，最后实现对C、T峰的定位，计算峰面积。实验结果显示，在501000 pg/ml范围具有良好的线性，线性相关系数不小于0.998，相对误差为1.23%3.93%。结果表明，提出的自适应边界检测算法对弱峰识别能力更强，提高了峰图定位的准确度。关键词：荧光免疫层析；小波变换；边界自适应；寻峰算法中图分类号：O65 文献标识码：A DOI:10.11967/2023210207基金项目：天津市科技计划（No.20YFZCSY01160）*通讯作者：杜康，男，博士，研究方向：分析仪器研究，E-mail:作者简介：范昭阳，男，硕士，研究方向：分析仪器信号处理与谱峰识别，E-mail:F技术与应用生命科学仪器 2023 第21卷/1期510 引言荧光免疫层析技术是基于免疫标记技术与抗原抗体特异性免疫反应的检测技术1，具有操作简便、灵敏度高、受自然光干扰较低、稳定性好的优势，广泛的应用在各类低浓度分析物的即时测定2-4。荧光免疫层析的检测过程包括待测样本加入试纸条、等待反应、上机检测、荧光激发、光电传感器转换、计算机数据曲线拟合、寻峰等步骤5。荧光免疫层析试纸条的原理示于图1。图1 荧光免疫层析试纸条定量检测原理Fig.1 Quantitative detection principle即时检测（point-of-care testing，POCT）是在采样现场进行即时分析，通常不需要临床检验师操作，省去了实验室检验的复杂处理程序6。近几年，心脏标志物、传染性疾病与食品安全类免疫层析产品需求逐步上升，如新型冠状病毒的抗原检测7、白介素-6(IL-6)检测等。随着荧光材料和免疫技术的飞速发展，对荧光免疫层析分析仪的灵敏度和测量精度要求提高，但现阶段商用荧光免疫层析分析仪对低浓度待测物的T线（检测线）产生的T峰寻峰准确率低8，寻峰算法对弱峰寻找能力差，使得无法准确计算待测物质的浓度。因此在即时检测领域，急需提高仪器对低浓度产生微弱信号的寻峰能力9。常见的寻峰方法有直接寻峰法、质心探测法、高斯拟合法。直接寻峰法10计算简单，响应快，但抗噪能力弱；质心探测法11速度快，但准确度不高；高斯拟合法12的准确度较高，但是其对于峰图要求的规范化程度较高，低浓度微弱信号达不到规范化的要求。本文将小波变换算法应用于荧光免疫层析领域，采用寻找峰起点与终点的方式，用于对荧光免疫层析数据中峰图的定位。1 荧光免疫层析峰图定位本荧光免疫层析试纸条制作过程中因为材质、工艺等问题，峰值较低的情况下会出现峰起点和终点的偏移，峰宽并非固定值。图2 试纸条峰边界偏移Fig.2 Peak boundary shift of test strips目前荧光免疫层析在实际分析中因为峰图有对称性，为了简化模型，一般采用高斯（Gauss）线型13，使计算变得简单，且在待测样本浓度较高时误差对结果影响不大。基本原理是采用峰值点定位，再由峰值点向两侧截取固定距离作为目标峰的范围。但由于试纸条存在如图2所示的边界偏移的问题，峰值点定位的计算方式在待测样本为低浓度时会存在两种问题：1)寻不到峰2)对峰面积的计算误差太大2 自适应边界检测的寻峰算法本文基于小波变换的自适应边界检测的寻峰算法主要包括数据预处理，对数据进行小波变换，对处理的信号进行特征提取。离散小波变换是基于2的幂次进行尺度和位移操作，它的特点是没有冗余且更有效，因此在特征提取中得到了广技术与应用生命科学仪器 2023 第21卷/1期52泛地应用14。首先，导入荧光免疫层析分析仪的原始数据，建立一维数字滤波器，确定合适的小波基对原始数据进行变换，应用门限阈值对小波系数进行处理，对处理后的荧光信号进行特征提取，最终实现对C峰、T峰的准确定位。2.1 数据预处理本模型采用小波变换消除荧光免疫层析信号的基线漂移，对信号进行特征提取，最后实现峰值检测。将检测仪器上采集到的数据设定为原始数据，末尾添0满足小波分解个数，在实验中将个数定为了500位。建立一维数字滤波器，滤波模式为低通滤波。2.2 荧光免疫层析C、T峰定位对预处理后的荧光信号进行小波变换。本工作选择Daubechies小波作为小波母函数。dbN为具有N个消失矩的小波（N1），其没有明确的表达式，但转换函数的平方模是确定的，设荧光信号为(t)，其满足L2(R)，即(t)平方可积，将此信号做变换得到若干个信号分量，如式(1)所示，信号是由高频信号和低频信号组成的15。（1）其中是尺度函数，(t)是小波函数，ai是小波变换的近似系数，bi,j为小波系数。设定的荧光免疫层析得到的荧光信号长度为500，所以式(1)的t的取值范围为0250。将数据保存MAT文件中，该文件包含两个变量coefs和longs，变量coefs是DWT系数的向量，longs是指定coefs每个分量的长度以及原始信号长度的向量。特征提取通过对信号通过局部极大值来识别脊线实现，步骤如下：图3 离散小波变换系数Fig.3 Discrete wavelet transform coefficient图4 有效脊线分布图与寻峰结果Fig.4 Distribution of effective ridgesand Peak search results(1)DWT系数矩阵为N500，N为DWT尺度数，500为荧光信号长度，根据在DWT系数矩阵中以最大尺度（n=N）识别出的局部极大值点初始化脊线，并将脊线的初始间隙数设为0；(2)对于间隙数小于某一阈值的每一条脊线，技术与应用生命科学仪器 2023 第21卷/1期53在系数矩阵中搜索下一相邻尺度下的最大点（第n-1行）。最近点之间允许的最大距离应小于该尺度的滑动窗口大小。如果没有找到最近点，则脊线的间隙数增加1，否则间隙数设为零。(3)保存间隙数大于阈值的脊线，并将其从搜索列表中删除。(4)对于没有连接到上层点的最大点，它们将作为新的脊线。(5)重复步骤2-4，直到它达到DWT系数矩阵中的最小行n=1。再根据上述步骤的脊线识别峰：(1)脊线最大振幅对应的刻度，与峰值宽度成正比，因此两条脊线之间则为峰的范围；(2)信噪比应大于某个阈值且脊线的长度应大于一定的值；最后可以得到8条脊线，划分出4个显著性区域，通过与原峰图对比（图4A），容易看出1、2、7、8这四处是整个荧光信号的起始与结束，在程序中加上采样点范围的限定条件可以将其排除，剩余的3、4和5、6分别为C峰和T峰起始点和结束点（图4B）。接下来计算峰面积，设定C峰起始点和终止点的横坐标为m和n，T峰起始点和终止点的横坐标为p和q，分别以Carea和Tarea来表示C、T峰的面积。（2）（3）3 实验与结果分析文献16研究表明了影响分辨率的小波变换系数为分解尺度，且随着分解尺度的增大，分辨率会增加，对弱峰的识别能力也会增加。但对于弱峰来说，分解尺度的增大也容易受重峰影响。为了验证研究效果，设计了本文算法与仪器传统算法的对比实验。3.1 荧光测定仪器使用天津博硕科技有限公司的荧光免疫层析分析仪（Symphony-2080）；新型冠状病毒抗原检测试纸条和SARS-CoV-2 N protein标准溶液由华科泰生物技术有限公司提供，抗原裂解液购于杭州博岳生物技术有限公司。以SARS-CoV-2 N protein标准溶液为检测样本，选用1000pg/ml的标准溶液为本次实验的母液，用抗原裂解液分别稀释为500 pg/ml、200 pg/ml、100 pg/ml、50 pg/ml、20 pg/ml的浓度梯度，并设置一组只含有抗原检测裂解液的试纸条作为空白对照。等待15分钟后，使用荧光免疫层析分析仪进行检测，记录仪器传统算法的实验结果。再从数据库中导出仪器未处理过的原始信号，导入Matlab中通过本文算法进行计算，并通过计算性能指标17对结果进行评估。3.2 线性分析将每个浓度随机挑选的3根试纸条的测量值均值进行曲线拟合，浓度范围如“3.1”所述。实验结果的线性回归分析示于图5，得到特征值T/C和浓度的拟合式如下。（4）上式中y为T峰面积与C峰面积的比值，x为样品浓度。相关系数不小于0.998，表明了该方法的精度较高，测定值与实际值有很好的相关性，可以满足定量分析的需求。技术与应用生命科学仪器 2023 第21卷/1期54图5 有检测范围线性关系Fig.5 Linearity of detection ranges3.3 准确度分析对各浓度计算相对误差，结果见表1。其中，本文算法的相对误差为1.23%3.93%，相比于仪器自有的传统算法，本文算法能准确检测的浓度更低，可达50 pg/ml，且在500 pg/ml和1000 pg/ml准确率更高。样本浓度为20 pg/ml时，特征值与空白试纸条近似，因此本系统可检测最低限度为50 pg/ml。表1 5个浓度梯度T/C的相对误差Tab.1 Relative Error of concentration gradients T/C3.4 重复性分析重复性是评估分析仪器的重要指标。在定量检测中，重复性决定了检测结果的可靠性。对50 pg/ml、100 pg/ml和1000 pg/ml三种浓度分别选取10个不同的待检试纸条进行重复性检测，检测结果的变异系数和标准差如表2所示。表2 3个浓度T/C重复性的变异系数Tab.2 CV and SD of T/C repeatabilityfor three concentrations重可以看出，50 pg/ml和100 pg/ml的重复性都在5%以下，且100 pg/ml对于50 pg/ml重复性有较大提升。本算法所得结果的线性、准确度和重复性都达到了荧光免疫层析分析仪的技术指标要求17。3.5 算法测试与评估从华科泰生物技术有限公司的质控试纸条中随机抽取5根使用本文算法进行测试，并与天津博硕科技有限公司仪器自有传统算法进行对照，结果示于表3。表3 随机抽取质控条测试误差对比Tab.3 Comparison of test error of randomly selected quality control strip试纸条2和5浓度在500 pg/ml以下，不在仪器传统算法的检测范围内，因此误差大于15%。本文算法的误差能控制在5%以内，相较于仪器内置的传统算法有了明显提高。4 结论及意义针对目前荧光免疫层析分析仪对低浓度待测物T线产生的T峰寻峰准确率较低，导致仪器无法定量检测的情况，引入小波变换的方法；利用小波变换算法对数据进行处理，通过局部极大值识别脊线，判断C、T峰的起点与终点，完成对峰的定位。结合实验效果，与仪器的传统算法相比，本文所用算法在低浓度范围下的弱峰识别能力更强。实验结果证明，本算法研究有望推动荧光免疫层析在低浓度分析物的定量检测应用，对相关仪器的发展有重要意义。参考文献1周梦婕,李小盼,代荣阳,阎锡蕴,段德民.免疫层析试纸条检测技术的研究进展J.检验医学与临床,2019,16(22):3382-3386.2Fabio Di Nardo,Matteo Chiarello,Simone Cavelera,et al.Ten Years of Lateral Flow Immunoassay Technique Applications:Trends,Challenges and Future PerspectivesJ.技术与应用生命科学仪器 2023 第21卷/1期55Sensors,2021,21(15):5185.3Li H,Wang D,Tang X,et al.Time-Resolved Fluorescence Immunochromatography Assay(TRFICA)for Aflatoxin:Aiming at Increasing Strip Method SensitivityJ.Frontiers in Microbiology,2020,11:676.4Shao L,Zhang L,Li S,et al.Design and Quantitative Analysis of Cancer Detection System Based on Fluorescence Immune AnalysisJ.Journal of Healthcare Engineering,2019,2019(10):1-9.5刘鑫.荧光免疫层析分析仪的设计分析J.生命科学仪器,2015,(3):23-26.6Ralph-Sydney Mboumba Bouassa,David 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