基于药效的氟康唑氯化钠注射液处方工艺筛选.pdf

558药品评价 Drug Evaluation 2023,20（5）基于药效的氟康唑氯化钠注射液处方工艺筛选侯海婷1，路晓兵1，赵方红1，左亚茹1，崔雪妹1，杨娴1,21.石家庄四药有限公司研发中心，河北省大容量注射剂工程技术研究中心，河北 石家庄 050000；2.石家庄四药有限公司博士后科研工作站，河北 石家庄 050000摘要：目的 建立系统性真菌感染模型，基于抗真菌活性筛选氟康唑氯化钠注射液的处方工艺，为其进一步处方工艺路线的确定和工艺参数的选择提供参考。方法 通过 ICR 小鼠尾静脉注射白色念珠菌，制备系统性真菌感染小鼠模型；以上市氟康唑氯化钠注射液为阳性对照药，分别尾静脉注射给予不同剂量不同工艺的供试氟康唑氯化钠注射液 Y1 和Y2，通过观察系统性真菌感染小鼠在给药后的生存曲线和肾脏载菌量变化，比较供试品 Y1、Y2 的体内抗真菌活性，并比较其与上市氟康唑氯化钠注射液的活性差异。结果 上市氟康唑氯化钠注射液、Y1、Y2 在 ICR 小鼠体内具有抗白色念珠菌活性，且剂量依赖性地有效延长系统性真菌感染小鼠的存活时间，并提高小鼠的生存率（P0.001）；上市氟康唑氯化钠注射液、Y1、Y2 均能有效减少系统性真菌感染小鼠肾脏载菌量（P0.05），且呈剂量依赖性。结论 Y1、Y2 的体内抗真菌活性与阳性对照药相当，氟康唑氯化钠注射液不同处方工艺对其体内抗真菌活性无影响。关键词：氟康唑；工艺学,制药；药效学；工艺筛选；真菌感染；小鼠,近交 ICRDOI:10.19939/ki.1672-2809.2023.05.09Screening of Preparation Process of Fluconazole and Sodium Chloride Injection Based on PharmacodynamicsHOU Haiting1,LU Xiaobing1,ZHAO Fanghong1,ZUO Yaru1,CUI Xuemei1,YANG Xian1,21.Pharmaceutical Research Institute of Shijiazhuang No.4 Pharmaceutical Co.,Ltd.,Hebei Large Capacity Injection Engineering Technology Research Center,Shijiazhuang Hebei 050000,China;2.Postdoctoral Research station of Shijiazhuang No.4 Pharmaceutical Co.,Ltd.,Shijiazhuang Hebei 050000,China.Abstract:Objective To establish a systemic fungal infection model and screen the prescription technology of fluconazole and sodium chloride injection based on antifungal activity,so as to provide reference for the determination of its further prescription process route and the selection of process parameters.Methods In this experiment,the mice model of systemic fungal infection was prepared by injecting candida albicans into the tail vein of ICR mice.fluconazole and sodium chloride injection was used as a positive control drug,and,different doses of test fluconazole and sodium chloride injection Y1 and Y2 were injected into the tail vein respectively.By observing the survival curve of mice with systemic fungal infection and the changes in kidney bacterial load after administration,the antifungal activity of the test product in vivo was verified,and the activity differences between them and fluconazole and sodium chloride injection were compared.Results fluconazole and sodium chloride injection,Y1 and Y2 injection had anti-candida albicans activity in ICR mice,and could effectively prolong the survival time of ICR mice infected with systemic fungal and improve the survival rate of ICR mice(P0.001);fluconazole and sodium chloride injection,Y1 and Y2 injection could effectively reduce the renal bacterial load of ICR mice with systemic fungal infection(P0.05).Conclusion In vivo antifungal activity of Y1 and Y2 are not significantly different from that of positive control drug.The different preparations of fluconazole and sodium chloride injection have no effect on the antifungal activity in vivo.Key words:Fluconazole;Technology,pharmaceutical;Pharmacodynamics;Prescription technology screening;Fungal infection;Mice,inbred ICR作者简介：侯海婷，硕士。研究方向：药物安全性评价。E-mail:通信作者：杨娴，博士，高级工程师。研究方向：新药非临床研究。E-mail:系统性真菌感染（system fungal infection，SFI）为一类由真菌引起的、侵犯深部脏器和/或血液的严重感染1。近年来，在器官移植患者、癌症患者、艾滋病患者中，系统性真菌感染为其主要死亡原因，并且死亡率逐年升高2。白色念珠菌是临床最常见的系统性真菌感染致病菌，对于免疫力低下的病人，白色念珠菌能够入侵深层组织或进入血液559药品评价 Drug Evaluation 2023,20（5）循环系统，引发深部或者系统性真菌感染，威胁生命，死亡率高达 46%75%3-6。氟康唑作为一种广谱的三唑类抗真菌药物，因其毒副作用小、对深部真菌感染疗效显著及药代动力学特征优良等特点，成为 WHO 指定的治疗全身性真菌感染的首选药物7。目前，国内氟康唑氯化钠注射液的需求量稳步攀升，但国内仅有少数几家企业的产品通过或者视同通过注射剂一致性评价。石家庄四药有限公司研发中心（以下简称：本研发中心）对氟康唑氯化钠注射液处方和生产工艺进行了优化筛选，药学研究数据表明与氟康唑氯化钠注射液上市参比制剂质量相当。为进一步验证氟康唑氯化钠注射液的体内抗真菌活性，并比较不同处方工艺对其体内抗真菌活性的影响，根据其临床适应证，设计了氟康唑氯化钠注射液抗系统性真菌感染的药效学实验，为其进一步处方工艺路线的确定和工艺参数的选择提供参考。1 材料1.1 药品Y1：工艺 A 氟康唑氯化钠注射液，由石家庄四药研发中心提供（规格：100 mL:氟康唑 0.2 g 与氯化钠 0.9 g，批号：1609201805）。Y2：工艺 B 氟康唑氯化钠注射液，由石家庄四药研发中心提供（规格：100 mL:氟康唑 0.2 g 与氯化钠 0.9 g，批号：1609201805a）。Dif：氟康唑氯化钠注射液，法国辉瑞公司PFIZER PGM（进口药品注册证号 H20181194，规格：100 mL:氟 康 唑 0.2 g 与 氯 化 钠 0.9 g，批 号：B197105）。1.2 动物ICR 小 鼠，160 只，雌 性，68 周，1822 g，上海西普尔-必凯实验动物有限公司，清洁级，实验动物许可证号：SCXK（沪）20130016。所有动物处于 12 h 控制昼夜的房间，给予自由饮水和饮食。实验符合实验动物伦理委员会的伦理学标准。1.3 菌株白色念珠菌（Candida albicans，SC5314），由第二军医大学药学院新药研究中心真菌菌种库提供。2 方法2.1 药物配制Dif、Y1、Y2 用生理盐水分别配制成 0.02 mg/mL、0.05 mg/mL、0.125 mg/mL 的溶液。上述所有供试药物现配现用。2.2 菌液配制白色念珠菌 SC5314 培养于 30 的 YEPD 培养液中，200 rpm 振荡培养，活化 24 h。取处于指数生长期的细胞，培养于 30的 YEPD 培养液中，200 rpm 振荡培养，活化 16 h。取活化两代菌液 3 000 r/min 离心 5 min，用 0.9%生理盐水洗涤3 次至上清液无色，弃去上清液，以 0.9%生理盐水将菌液浓度调为实验所需浓度。2.3 系统性真菌感染小鼠生存实验100 只小鼠，按体重随机分为 10 组（n=10），模型组（NS），Dif 高、中、低剂量组，Y1 高、中、低剂量组，Y2 高、中、低剂量组。所有小鼠尾静脉注射 5106 cell/mL 新配制的菌液 0.1 mL/10 g体质量，约为 0.2 mL。在小鼠系统性真菌感染模型建立 2 h 后，每组低、中、高分别按 0.2 mg/kg、0.5 mg/kg、1.25 mg/kg 尾静脉注射 Dif、Y1、Y2，模型组注射等体积的生理盐水，连续给药 7 d。记录造模后 30 d 内系统性真菌感染 ICR 小鼠的生存时间，并计算生存率，绘制生存曲线。2.4 系统性真菌感染小鼠肾脏载菌实验60 只小鼠，按体重随机分为 10 组（n=6），模型组，Dif 高、中、低剂量组，Y1 高、中、低剂量组，Y2 高、中、低剂量组。造模及给药方法如 2.3。末次给药后 24 h，脱颈处死，取下左右双侧肾脏，称量其总重量。将左右肾脏置 1 mL PBS 中研磨匀浆，并依次稀释至匀浆液的 1/10、1/100、1/1 000 三个浓度，分别取 100 L 稀释液涂于 SDA 板，30 培养 48 h，通过计数 SDA 板上的菌落数，计算肾脏载菌量。2.5 统计学方法Kaplan-Meier 法分析小鼠的生存情况，Log-rank 法评估生存曲线。ANOVA 和 post hoc 法分析载菌量。3 结果3.1 Y1 与 Y2 对系统性真菌感染小鼠存活时间的影响实验结果显示，与模型组比，Dif 0.2 mg/kg、0.5 mg/kg、1.25 mg/kg 剂量组的系统性真菌感染ICR 小鼠生存曲线均显著延长，均差异有统计学意义（P0.001）。与模型组比，Y1、Y2 的 0.2 mg/kg、0.5 mg/kg、1.25 mg/kg 剂量组的系统性真菌感染ICR 小鼠生存曲线均显著延长，均差异有统计学意义（P0.05）。Y1 与 Y2 的相同剂量组比，其生存曲线的差异无统计学意义（P0.05）。结果见图 1，表 1。表1 Y1、Y2治疗真菌感染小鼠的平均存活时间组别剂量/（mg/kg）平均存活时间（）/dNS-7.101.60Dif 低0.2 13.34.24Dif 中0.5 16.44.31Dif 高1.25 25.87.07Y1 低0.2 15.36.18Y1 中0.5 17.05.41Y1 高1.2524.06.72Y2 低0.216.87.58Y2 中0.516.77.35Y2 高1.2521.08.853.2 Y1与Y2对系统性真菌感染小鼠肾脏载菌量的影响实验结果显示，与模型组比，Dif 0.2 mg/kg、0.5 mg/kg、1.25 mg/kg 剂量组的小鼠肾脏载菌量显著下降，差异有统计学意义；Y1 的 0.2 mg/kg、0.5 mg/kg、1.25 mg/kg 剂量组小鼠的肾脏载菌量显著下降，差异有统计学意义；Y2 的 0.2 mg/kg、0.5 mg/kg、1.25 mg/kg 剂量组的小鼠肾脏载菌量也显著下降，差异有统计学意义；小鼠肾脏的载菌量随 Dif、Y1、Y2 剂量的增加而降低。Y1、Y2 各剂量组与 Dif 注射液相同剂量组比，小鼠肾脏的载菌量差异无统计学意义（P0.05）；Y1、Y2 相同剂量组比，小鼠肾脏的载菌量差异无统计学意义（P0.05）。结果见表 2。表2 Y1、Y2对小鼠肾脏载菌量的影响（）组别剂量肾脏重量/g菌量（lg）/g 肾脏NS0.1 mL/10g0.2810.0255.820.294Dif 低0.2 mg/kg0.2400.0235.470.234aDif 中0.5 mg/kg0.2490.0244.240.353bDif 高1.25 mg/kg0.2340.0273.700.542bY1 低0.2 mg/kg0.2490.0244.890.519cY1 中0.5 mg/kg0.2560.0214.210.728bY1 高1.25 mg/kg0.2470.0294.070.717bY2 低0.2 mg/kg0.2490.0275.430.206aY2 中0.5 mg/kg0.2430.0224.550.317bY2 高1.25 mg/kg0.2460.0253.940.410b注：与NS（模型组）比较，aP0.05，bP0.001，cP0.01。4 讨论氟康唑氯化钠注射液上市多年，多用于包括念珠菌病、隐球菌病、球孢子菌病、芽生菌病和组织胞质菌病等多种真菌感染性疾病的治疗，疗效确切8-9。与其他抗真菌药相比，氟康唑性质稳定，安全性较高，不良反应发生率低，是目前临床应用较多的抗真菌药之一10。本研发中心对氟康唑氯化钠注射液进行了研发，药学研究数据表明与上市氟康唑氯化钠注射液质量相当。本实验利用小鼠建立系统性真菌感染动物模型，结合体内抗菌的药效学评价方法，观察氟康唑氯化钠注射液不同制备工艺在抑制白色念珠菌方面的体内药效，并与已上市氟康唑氯化钠注射液进行对比。尾部静脉注射白念珠菌建立白色念珠菌感染图1 Y1、Y2治疗真菌感染小鼠的生存曲线：A.Y1注射液治疗真菌感染小鼠的生存曲线；B.Y2注射液治疗真菌感染小鼠的生存曲线累积生存函数累积生存函数AB561药品评价 Drug Evaluation 2023,20（5）模型的用量是在参考文献和预实验的基础上确定的11-13。系统性白色念珠菌感染是导致免疫力低下患者死亡的重要原因14。上市氟康唑氯化钠注射液、Y1、Y2 在 ICR 小鼠体内具有抗白色念珠菌活性，且剂量依赖性地有效延长系统性真菌感染 ICR 小鼠的存活时间，并提高 ICR 小鼠的生存率（P0.05）；Y1、Y2 相同剂量组比，其生存曲线差异无统计学意义（P0.05）。所建立的小鼠系统性白色念珠菌感染模型与人体感染比较相似，感染的最主要靶器官都是肾脏15。上市氟康唑氯化钠注射液、Y1、Y2 均能有效减少系统性真菌感染 ICR 小鼠肾脏载菌量（P0.05）；Y1、Y2相同剂量组比，其肾脏载菌量差异无统计学意义（P0.05）。综上所述，受试药物氟康唑氯化钠注射液 Y1、Y2 在小鼠体内具有抗真菌活性，其抗真菌活性与参比制剂上市氟康唑氯化钠注射液的作用相当，且Y1、Y2 的抗真菌活性均随药物浓度的增加而增强；Y1、Y2 的体内抗真菌活性差异无统计学意义，表明氟康唑氯化钠注射液不同的处方工艺对其体内抗真菌活性基本无影响。参考文献1 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and VPS32 affect growth at alkaline pH and virulence through both RIM101-dependent and RIM101-independent pathways in candida albicansJ.Infec Immun,2005,73(12):7977-7987.12 TAKAGI J,SINGH-BABAK S D,LOHSE M S,et al.Candida albicans white and opaque cells exhibit distinct spectra of organ colonization in mouse models of infectionJ/OL.PLoS One,2019,14(6):e0218037.DOI:10.1371/journal.pone.0218037.13 ZHANG L X,YAN K Z,ZHANG Y,et al.High-throughput synergy screening identifies microbial metabolites as combination agents for the treatment of fungal infectionsJ.Proc Nati Acad Sci U S A,2007,104(11):4606-4611.14 杨琼,宋祥福,王桂云.系统性白色念珠菌感染小鼠动物模型的研究 J.东北师大学报自然科学版,2005,37(2):86-89.15 PAPADIMIYRIOU J M,ASHMAN R B.The pathogensis of acute systemic candidiasis in a susceptible inbred mouse strainJ.J Pathol,1986,150(4):257-265.收稿日期：2023-01-13 定稿日期：2023-04-28