基于血浆代谢组学筛选日粮纤维影响二花脸猪肉质性状的候选代谢物.pdf

畜牧兽医学报 2 0 2 3,5 4(9):3 7 5 8-3 7 6 9A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i:1 0.1 1 8 4 3/j.i s s n.0 3 6 6-6 9 6 4.2 0 2 3.0 9.0 1 6开放科学(资源服务)标识码(O S I D):基于血浆代谢组学筛选日粮纤维影响二花脸猪肉质性状的候选代谢物张兆博1,侯黎明1,李平华1,杜陶然1,王中宇1,吴承武2,黄瑞华1*(1.南京农业大学养猪研究所,南京 2 1 0 0 9 5;2.南京农业大学淮安研究院,淮安 2 2 3 0 0 1)摘 要:本课题组前期研究发现,7%的麸皮替代基础日粮可以显著改善二花脸猪背最长肌红度值,提高其肉品质,但其潜在的生理和分子调控机理未知。旨在利用非靶向代谢组学技术,鉴别日粮纤维影响二花脸猪肉质性状的候选代谢物;并利用二花脸猪肌管细胞体外探究日粮纤维影响二花脸猪肉品质的潜在生理和分子调控机理。本试验利用非靶向代谢组学技术检测基础日粮组和7%麸皮替代基础日粮组二花脸猪血浆样品的差异代谢物,并与肉质表型数据进行联合分析,鉴别日粮纤维影响二花脸猪肉质性状的候选代谢物。然后利用候选代谢物处理体外分离培养的二花脸猪肌管细胞,研究其对肌纤维类型转变的影响。结果显示,在基础日粮组和7%麸皮替代基础日粮组之间共鉴定到9个差异代谢物,其中4个差异代谢产物在基础日粮组含量较高,5个差异代谢产物在7%麸皮替代基础日粮组含量较高。K E G G通路分析显示,二花脸猪的血浆差异代谢产物主要富集在黑色素生成途径、A B C转运体途径、酪氨酸和色氨酸生物合成途径等代谢途径上。通过与前期研究获得的肉质表型数据进行相关性分析发现,血浆差异代谢物十七烷酸与二花脸猪背最长肌2 4 h 红度值(a2 4 h)呈显著正相关。体外细胞研究表明,十七烷酸处理二花脸猪肌管细胞,提高了I型肌纤维类型标记基因 M yHC I的表达水平。综上,适量的日粮纤维添加改变了二花脸猪血浆中十七烷酸的水平,进而通过提高 M y HC I基因的表达改善二花脸猪背最长肌的肉色,提高其猪肉品质。关键词:二花脸猪;日粮纤维;血浆代谢组学;十七烷酸中图分类号:S 8 2 8.2 文献标志码:A 文章编号:0 3 6 6-6 9 6 4(2 0 2 3)0 9-3 7 5 8-1 2收稿日期:2 0 2 3-0 2-1 3基金项目:国家自然科学基金面上项目(3 2 1 7 2 7 1 0);江苏省农业自主创新项目(C X(2 0)1 0 0 3)作者简介:张兆博(1 9 9 6-),男,山东夏津人,硕士生,主要从事猪肌肉发育与调控研究,E-m a i l:z h a o b o 1 3 1 21 2 6.c o m*通信作者:黄瑞华,主要从事猪健康生产学与遗传育种学研究,E-m a i l:r h h u a n g n j a u.e d u.c nS c r e e n i n g C a n d i d a t e M e t a b o l i t e s o f D i e t a r y F i b e r A f f e c t i n g M e a t Q u a l i t y T r a i t s o f E r h u a l i a n P i g s B a s e d o n P l a s m a M e t a b o l o m i c sZ HANG Z h a o b o1,HOU L i m i n g1,L I P i n g h u a1,DU T a o r a n1,WANG Z h o n g y u1,WU C h e n g w u2,HUANG R u i h u a1*(1.I n s t i t u t e o f S w i n e S c i e n c e,N a n j i n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y,N a n j i n g 2 1 0 0 9 5,C h i n a;2.H u a ia n A c a d e m y,N a n j i n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y,H u a ia n 2 2 3 0 0 1,C h i n a)A b s t r a c t:P r e v i o u s s t u d y i n a u t h o r s r e s e a r c h g r o u p h a v e f o u n d t h a t 7%b r a n r e p l a c e m e n t b a s a l d i e t c a n s i g n i f i c a n t l y i m p r o v e t h e r e d n e s s v a l u e o f L o n g i s s i m u s d o r s i m u s c l e o f E r h u a l i a n p i g s a n d i m p r o v e t h e i r m e a t q u a l i t y,b u t i t s p o t e n t i a l p h y s i o l o g i c a l a n d m o l e c u l a r r e g u l a t o r y m e c h a-n i s m s r e m a i n u n k n o w n.T h e a i m o f t h e s t u d y w a s t o i d e n t i f y t h e c a n d i d a t e m e t a b o l i t e s o f d i e t a r y f i b e r a f f e c t i n g m e a t q u a l i t y t r a i t s o f E r h u a l i a n p i g s u s i n g n o n-t a r g e t e d m e t a b o l o m i c s t e c h n o l o g y a n d t o e x p l o r e t h e p o t e n t i a l p h y s i o l o g i c a l a n d m o l e c u l a r r e g u l a t o r y m e c h a n i s m o f d i e t a r y f i b e r 9期张兆博等:基于血浆代谢组学筛选日粮纤维影响二花脸猪肉质性状的候选代谢物a f f e c t i n g t h e m e a t q u a l i t y u s i n g a n i n v i t r o m y o t u b e s d e r i v e d f r o m E r h u a l i a n p i g s.D i f f e r e n t i a l p l a s m a m e t a b o l i t e s b e t w e e n b a s a l d i e t g r o u p a n d 7%b r a n r e p l a c e m e n t b a s a l d i e t g r o u p w e r e d e-t e c t e d b y n o n-t a r g e t e d m e t a b o l o m i c s t e c h n o l o g y i n E r h u a l i a n p i g s,t h e n t h e c o r r e l a t i o n b e t w e e n d i f f e r e n t i a l p l a s m a m e t a b o l i t e s a n d m e a t q u a l i t y p h e n o t y p e d a t a w e r e a n a l y z e d t o i d e n t i f y d i e t a r y f i b e r c a n d i d a t e m e t a b o l i t e s a f f e c t i n g t h e m e a t q u a l i t y t r a i t s o f E r h u a l i a n p i g s.T h e n t h e c a n d i d a t e m e t a b o l i t e w a s u s e d t o t r e a t E r h u a l i a n p i g m y o t u b e s i n v i t r o t o s t u d y i t s e f f e c t o n t h e t r a n s f o r-m a t i o n o f m u s c l e f i b e r t y p e s.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t,a t o t a l o f 9 d i f f e r e n t i a l m e t a b o l i t e s w e r e i d e n t i f i e d b e t w e e n t h e b a s a l d i e t g r o u p a n d t h e 7%b r a n r e p l a c e m e n t b a s a l d i e t g r o u p,o f w h i c h 4 d i f f e r e n t i a l m e t a b o l i t e s h a d h i g h e r l e v e l i n t h e b a s a l d i e t g r o u p a n d 5 d i f f e r e n t i a l m e t a b o l i t e s h a d h i g h e r l e v e l i n t h e 7%b r a n r e p l a c e m e n t b a s a l d i e t g r o u p.K E G G p a t h w a y a n a l y s i s s h o w e d t h a t p l a s m a d i f f e r e n t i a l m e t a b o l i t e s o f E r h u a l i a n p i g s w e r e m a i n l y i n v o l v e d i n m e l a n i n g e n e r a t i o n p a t h w a y,A B C t r a n s p o r t e r p a t h w a y a n d t y r o s i n e a n d t r y p t o p h a n b i o s y n t h e s i s p a t h w a y,e t c.T h e p l a s m a m e t a b o l i t e h e p t a d e c a n o i c a c i d w a s f o u n d t o b e p o s i t i v e l y c o r r e l a t e d w i t h t h e 2 4 h r e d n e s s v a l u e(a2 4 h)o f L o n g i s s i m u s d o r s i m u s c l e o f E r h u a l i a n p i g s b y c o r r e l a t i o n a n a l y s i s w i t h t h e m e a t q u a l i t y p h e n o t y p e d a t a o b t a i n e d i n p r e v i o u s s t u d i e s.T h e r e s u l t s o f i n v i t r o c e l l e x p e r i m e n t s s h o w e d t h a t t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f t y p e I m u s c l e f i b e r t y p e m a r k e r g e n e M y HC I w a s i n c r e a s e d b y h e p t a d e c a n o i c a c i d t r e a t m e n t i n E r h u a l i a n p i g m y o t u b e c e l l s.I n s u mm a r y,a p p r o p r i a t e d i e t a r y f i b e r s u p p l e m e n t a t i o n c h a n g e d t h e p l a s m a m e t a b o l o m e o f E r h u a l i a n p i g s,a n d h e p t a d e c a n o i c a c i d m a y i m p r o v e t h e f l e s h c o l o r o f L o n g i s s i m u s d o r s i m u s c l e o f E r h u a l i a n p i g s b y i n c r e a s i n g t h e e x-p r e s s i o n o f M y HC I g e n e a n d t h u s i m p r o v e d t h e q u a l i t y o f p o r k.K e y w o r d s:E r h u a l i a n p i g s;d i e t a r y f i b e r;p l a s m a m e t a b o l o m i c s;h e p t a d e c a n o i c a c i d*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r:HUANG R u i h u a,E-m a i l:r h h u a n g n j a u.e d u.c n 我国猪肉消费需求已从“量稳”进入“质升”阶段,如何改善猪肉品质已成为畜牧业生产的新目标。以往有较多研究发现日粮纤维可以影响猪肉品质,但因日粮纤维代谢过程复杂,对机体的调控形式也可能存在直接或间接的作用途径,导致其作用机理研究一直不清。日粮纤维是指饲料中不能被动物分泌的消化酶直接消化的细胞壁成分,主要包括纤维素、半纤维素、果胶和木质素等。本课题组前期研究发现:与同生理阶段和同体重的大白猪育肥阉公猪相比,二花脸猪可以耐受更高的纤维日粮,且7%的麸皮替代基础日粮可以显著提高二花脸猪背最长肌红度值(a值),初步分析发现,7%的麸皮替代基础日粮改变了二花脸猪肌纤维类型,肌纤维类型标记基因M y HC I的mR NA表达水平升高,而M y HC I I b和M y HC I I x的mR NA和蛋白表达水平显著降低1,提示适量的日粮纤维添加可通过改变肌纤维类型改善二花脸猪的肉色,提高猪肉品质。日粮纤维在猪体内主要由后肠定植的微生物发酵生成短 链脂肪酸(s h o r t c h a i n f a t t y a c i d s,S C-F A s)、C O2、H2等物质2,同时日粮纤维可能通过影响肠道微生物的平衡和代谢,诱导微生物产生氨基酸、小肽等小分子代谢物3-6,调控动物整体代谢和健康。近年来,随着D NA高通量测序、基因组学等技术和学科的快速发展,特别是代谢组学技术的日益成熟,为研究日粮纤维的分子营养调控机制提供了新的方法与思路。代谢组学是研究生物体受到干预前后代谢产物图谱及其动态变化的一种技术,具有技术通用性强、数据库简易等特点7,且代谢处于生命调控过程的末端,相较于其他组学而言,代谢组学提供的是生物学的终端信息,更接近于生物体表型8。作为“后基因组学时代”的一项新兴技术,代谢组学平台在动物营养调控的研究中已经得到了广泛的应用9,但基于代谢组学技术解析日粮纤维调控猪肉品质机理的研究还鲜见报道。因此,本研究选择可代表和体现生物体整体生理系统代谢变化特征的二花脸猪血浆样品1 0,采用G C-M S非靶标代谢组学技术对其代谢物进行全面分析、鉴定和比较,并在体外细胞水平开展代谢物的功能验证试验,探究日粮纤维对猪血浆代谢物的影响,筛选日粮纤维影响二花脸猪肉质性状的候选代谢物,为揭示日9573畜 牧 兽 医 学 报5 4卷 粮纤维的营养功能并对其进行合理的应用提供理论依据。1 材料与方法1.1 试验材料本研究以二花脸猪基础日粮组(EHL_0%)和7%麸皮替代基础日粮组(EHL_7%)的血浆样品为试验材料1。试验用到的细胞分离自1日龄二花脸公猪的背最长肌(购自常熟市畜禽良种有限公司)。型胶原酶、胰蛋白酶和L多聚赖氨酸购自S i g m a公司;DMEM/F 1 2培养基、丙氨酰谷氨酰胺(G l u-t a m a x)、非必需氨基酸(N E AA)和丙酮酸钠(S o d i-u m P y r u v a t e)购自G i b c o公司;胎牛血清(F B S)购自D C E L L B i o l o g i c s公司;细胞生长因子(b F G F)购自P e p r o T e c h公司;血清替代物(U l t r o s e r G)购自美国P A L L公司;双抗(青霉素、链霉素)购自H y-c l o n e公司。1.2 试验设计本研究中血浆代谢组学所用到的样品材料与前期本课题组已发表的文章1相同。选择二花猪基础日粮组(EHL_0%,5.1 3%A D F,1 2.8 4%N D F)和7%麸皮替代基础日粮组(EHL_7%,5.7%A D F,1 4.4 3%N D F)正试期第2 8天的血浆样品进行非靶向代谢组学检测,鉴定两个组别差异代谢物,并与前期基础日粮组和7%麸皮替代基础日粮组二花脸猪背最长肌的肉质表型结果(肉色、p H和滴水损失)进行相关性分析,鉴别日粮纤维影响二花脸猪肉质性状的候选代谢物,探究肉质性状与代谢物之间的相互关系;然后在体外分离培养二花脸猪的肌卫星细胞并诱导分化获得肌管细胞,评价遴选的候选代谢产物对二花脸猪肌管细胞肌纤维类型转变的影响,探究日粮纤维影响二花脸猪肉品质的潜在调控机理。1.3 猪血浆收集与样品处理正试期第2 8天,所有试验猪通过前腔静脉采集全血于肝素抗凝管中,上下轻轻颠倒混匀后,室温静置3 0 m i n,3 0 0 0 rm i n-1离心1 0 m i n,吸取上清液,制作血浆样本,随后将血浆转移至1.5 m L离心管中,液氮速冻后,于-8 0 冰箱保存。在开展G C-M S代谢组检测时,从-8 0 冰箱取出样品,4 缓慢融解后分别取各组样品2 0 0 L,加入3 0 0 L提取液(v(甲醇):v(乙腈)=2 1(含5%的内标L-2-氯-苯丙氨酸);涡旋3 0 s混匀后,冰水浴超声萃取3 0 m i n;将样品于-2 0 静置3 0 m i n,然后高速离心1 5 m i n(4,1 3 0 0 0 rm i n-1);取上清,装入玻璃衍生小瓶中,氮气吹干;于玻璃衍生 小瓶中加入8 0 L的甲氧胺盐酸盐吡啶溶液(1 5 m gm L-1),涡旋2 m i n后于3 7 震荡培养箱中进行9 0 m i n肟化反应;再加入8 0 L的B S T F A(含1%TMC S)衍生试剂,涡旋2 m i n后于7 0 反应6 0 m i n;取出样本后,在 室 温 放 置3 0 m i n,进 行G C-M S代 谢 组 学检测。1.4 色谱-质谱(G C-M S)分析本试验所用分析仪器为A g i l e n t公司的8 8 9 0 B-5 9 7 7 B气相色谱质谱联用仪(A g i l e n t,U S A)。衍生化后样本用分流模式注入G C-M S系统进行分析,进样量1 L,分流比1 0 1。样品经D B-5 M S毛细管柱(4 0 m 0.2 5 mm 0.2 5 m,A g i l e n t 1 2 2-5 5 3 2 G)分离后进入质谱检测。进样口温度 2 6 0,载气为高纯氦气,载气流速1 m Lm i n-1,隔垫吹扫流速3 m Lm i n-1,溶剂延迟5.5 m i n。升温程序为初始温度6 0,平衡0.5 m i n,然后以8 m i n-1的速度升至3 1 0,并维持6 m i n。质谱条件为电子轰击离子源(E I),传输线温度为3 1 0,离子源温度2 3 0,四极杆温度1 5 0,电子能量7 0 e V。扫描方式为全扫描模式(S C AN),质量扫描范围:5 05 0 0 mz-1,扫描频率为3.2 s c a ns-1。1.5 数据处理与分析G C-M S的原始文件经M a s s H u n t e r w o r k s t a-t i o n Q u a n t i t a t i v e A n a l y s i s(v 1 0.0.7 0 7.0)软件进行搜库鉴定及数据预处理,将质谱信息与代谢数据库进行匹配,根据质谱匹配度鉴定代谢物。主要数据库为F i e h n d a t a b a s e等商业数据库,导出C S V格式的三维数据矩阵,该矩阵信息包括样品名称、代谢物名称和峰面积等。将数据矩阵导入S I MC A-P 1 4.1软件,分别进行峰面积归一化、主成分分析(p r i n c i-p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s,P C A)和正交偏最小二乘判别分析(o r t h o g o n a l p a r t i a l l e a s t-s q u a r e s d i s c r i m-i n a t i o n a n a l y s i s,O P L S-D A)。以变量权重值(v a r i-a b l e i m p o r t a n t i n p r o j e c t i o n,V I P)1.0,且t检验(P0.0 5)为标准筛选差异代谢物,使用AMD I S软件进行差异代谢物定性鉴别、匹配分析。将匹配到的差异代谢物导入 M e t a b o A n a l y s t 5.0数据库进行代谢通路分析,同时借助K E G G数据库构建相关的代谢网络。再者,将课题组前期得到的肉质表型数据1与血浆中筛选出显著性差异代谢物进行相关0673 9期张兆博等:基于血浆代谢组学筛选日粮纤维影响二花脸猪肉质性状的候选代谢物性分析,以皮尔森相关系数为原理进行分析,计算肉质性状与差异代谢物的相关系数值,其数值的绝对值越大,说明两者关系越密切,P0.0 5表示显著相关,P0.0 1表示极显著相关,以H e a t m a p图展示两者之间的相关性。1.6 二花脸猪肌卫星细胞分离与鉴定选取1日龄健康纯种的二花脸仔猪,颈动脉放血处死后,用7 5%消毒酒精擦拭全身,进行消毒处理。在超净工作台内快速切取仔猪背最长肌样品,用含双抗的P B S冲洗肌肉2次后转移到无菌培养皿,用眼科镊、眼科剪尽可能地去除筋膜、神经、血管和脂肪组织,除去杂质的肌肉转入新的无菌培养皿,充分剪碎肌肉组织,约1 mm3大小。转移肌肉组织样品至细胞培养瓶,室温静置51 0 m i n,待肌肉样品沉淀后,用巴氏吸管吸弃上清。按照 2 1 体积比向肌肉组织样品中加入0.2 8%的 I 型胶原酶(即2.8 m gm L-1),3 7 水浴摇床震荡充分消化2 h,至组织样呈黄色黏稠状液体,充分消化后,加含胎牛血清的培养基终止消化,收集消化的细胞悬液和未消化完全的组织块经1 0 0目、2 0 0目细胞筛过滤。收集滤液,1 0 0 0 rm i n-1离心5 m i n,弃除上清液,在沉淀中加入适量的完全生长培养基重悬(完全培养基配方为:F 1 2/DM E M,2 0%F B S,1%G l u t a m a x,1%N E A A,1%S o d i u m P y r u v a t e,2 n gm L-1 b F G F,1%双抗),经细胞计 数后接种于 培养瓶中,置 于3 7、5 0 m LL-1 C O2的培养箱中静置培养2 h后,吸出上清于另一新培养瓶即为肌卫星细胞。纯化后的细胞接种培养瓶中培养,隔天进行换液,运用免疫荧光技术检测P a x 7蛋白的表达情况,P a x 7染色阳性细胞比例较高表明肌肉卫星细胞分离成功。1.7 免疫荧光染色将制备的猪肌卫星细胞接种至预放有细胞爬片的2 4孔板中,接种孔周围用无菌P B S填充,待细胞在爬片上生长融合至6 0%8 0%时,用P B S漂洗3次,加4%的多聚甲醛室温固定1 5 m i n,用0.2%T r i t o n X-1 0 0透化1 0 m i n,P B S洗3次,每次5 m i n;使用免疫荧光封闭液室温封闭3 0 m i n,加入P a x 7抗体(D e v e l o p m e n t a l S t u d i e s H y b r i d o m a B a n k,1 5 0)4 孵育过夜;P B S漂洗后用二抗C y 3山羊抗小鼠I g G(H+L)抗体(碧云天,A 0 5 2 1,1 1 0 0 0)避光室温孵育1 h;用D A P I(碧云天,C 1 0 0 2,1 5 0 0 0)染核5 m i n;P B S漂洗后用抗荧光淬灭封片剂封片,通过荧光显微镜捕获图像。1.8 代谢物十七烷酸处理二花脸猪肌管细胞将原代二花脸猪肌卫星细胞接种在6孔板上(设计5个组,每组2个重复,共1 0个孔),每个孔中的细胞数相等(约为51 05个);加入完全培养基培养细胞,待细胞生长至亚融合状态时,改用分化培养基(含0.4%血清替代物的DMEM/F 1 2培养基)进行诱导分化培养,分化至第4天时可观察到明显的多核肌管。根据十七烷酸的溶解度信息,首先用去离子水(d d H2O)作为溶剂配制成母液,然后用分化培养基稀 释到所需的工 作液浓度(0、0.2、2、2 0、2 0 0 m o lL-1),处理分化第4天的肌管细胞4 8 h,然后用浓度为0.0 1 2 5%的胰蛋白酶3 0 0 L消化上述肌管3 m i n,收集肌管细胞的R NA样品,然后通过实时荧光定量P C R检测不同肌纤维类型的标志基因M y HC I、M y HC I I a、M y HC I I b和M y HC I I x mR NA的表达水平。1.9 实时荧光定量P C R采用T R I z o l法提取细胞总R NA,通过试剂盒(E V O M-ML VR T K i t w i t h g D NA C l e a n f o r q P C R,艾科瑞)反转录合成c D NA后,参照C h a mQ S Y B R q P C R M a s t e r M i x(V a z y m e)说明书在Q u a-n t S t u d i o 5实时荧光定量P C R仪上进行实时荧光定量P C R检测。实时荧光定量P C R所用引物由北京擎科生物公司设计并合成,引物序列见表1。每个样本设3个重复,以G A P DH作为内参基因通过2-C t法换算目的基因相对表达量。将试验结果数据表示为“平均值标准差”,并采用S P S S 2 0.0软件对各组数据进行方差检验,以P1,同时P1,P v a l u e 1,P v a l u e 0.0 5 为了更直观地展示差异血浆代谢物在不同样本之间富集水平的差异,对血浆样本中所有显著差异代谢物进行层次聚类(图4)。结果显示,二花脸猪血浆差异代谢物明显分为两大类,其中D-t h r e i t o l、1,4-d i d e o x y-1,4-i m i n o-D-a r a b i n i t o l、t y r o s i n e和u r e a 4种代谢物在基础日粮组(EHL_0%)丰度较高,h e p t a d e c a n o i c a c i d、p-t o l u e n e s u l f o n i c a c i d、D-a l-l o s e、p i p e c o l i c a c i d和 b e t a-m y r c e n e 5种化合物在7%麸皮替代基础日粮组(EHL_7%)中丰度较高。从蓝到红颜色深度表示代谢物富集丰度从低到高。A 3 7 A 4 3为基础日粮组样品,B 3 8 B 5 1为7%麸皮替代基础日粮组样品C o l o r s f r o m b l u e t o r e d i n d i c a t e t h e e n r i c h m e n t l e v e l o f m e t a b o l i t e s f r o m l o w t o h i g h.A 3 7-A 4 3 w e r e t h e b a s a l d i e t g r o u p s a m p l e s,a n d B 3 8-B 5 1 w e r e t h e 7%b r a n r e p l a c e m e n t b a s a l d i e t g r o u p s a m p l e s图4 血浆差异代谢物聚类分析图F i g.4 C l u s t e r a n a l y s i s d i a g r a m o f d i f f e r e n t i a l m e t a b o l i t e s i n p l a s m a4673 9期张兆博等:基于血浆代谢组学筛选日粮纤维影响二花脸猪肉质性状的候选代谢物2.2 血浆差异代谢物的代谢通路分析为探究饲喂7%日粮纤维对二花脸猪代谢通路的影响,利用K E G G数据库对二花脸猪基础日粮组(E H L_0%)和7%麸皮替代基础日粮组(E H L_7%)血浆样品鉴定到的9个差异代谢物进行代谢通路富集分析,结果表明(图5),二花脸猪的血浆差异代谢产物主要富集的代谢途径包括:黑色素生成途径、A B C转运体途径、酪氨酸和色氨酸生物合成途径等。横坐标为富集率,纵坐标为K E G G通路。图中气泡的大小代表该通路中富集的差异代谢集的数量,气泡的颜色表示显著性富集P值的大小T h e x-a x i s r e p r e s e n t s t h e e n r i c h m e n t r a t e,a n d t h e y-a x i s r e p r e s e n t s K E G G p a t h w a y.I n t h e f i g u r e,t h e s i z e o f t h e b u b b l e r e p r e s e n t s t h e a m o u n t o f m e t a b o l i t e s e n r i c h e d i n t o t h e m e t a b o l i c s e t f o r s p e c i f i c p a t h w a y,a n d t h e c o l o r o f t h e b u b b l e r e p r e-s e n t s t h e m a g n i t u d e o f t h e s i g n i f i c a n c e e n r i c h m e n t P v a l u e图5 血浆差异代谢物的代谢通路分析图F i g.5 P a t h w a y a n a l y s i s d i a g r a m o f p l a s m a d i f f e r e n t i a l m e t a b o l i t e s2.3 血浆差异代谢物与肉质表型的相关性分析将课题组前期测定的二花脸猪肉质表型数据与血浆差异代谢物丰度值进行P e a r s o n相关性分析,结果发现仅有十七烷酸与二花脸猪背最长肌2 4 h的红度值(a2 4 h)呈显著的正相关(图6)。推测7%麸皮替代基础日粮组提高了代谢物十七烷酸的水平,进而提高了背最长肌2 4h的红度值(a2 4 h)。2.4 十七烷酸处理对二花脸猪肌管细胞M y H C I表达的影响 选用差速贴壁法分离二花脸猪骨骼肌肌卫星细胞(图7)。刚分离出的原代骨骼肌卫星细胞比较小,呈球形,折光性强;培养4 8 h后,细胞贴壁,呈梭形或纺形;7 2 h后贴壁完全,细胞逐渐延展成梭形。利用免疫荧光检测肌卫星细胞标记蛋白P a x 7的阳性率,发现刚分离的二花脸猪肌卫星细胞的纯度约为5 0%(图8),可用于后续代谢物的功能研究。为研讨十七烷酸对二花脸猪肌管细胞肌纤维类型组 成 的 影 响,利 用 不 同 浓 度(0、0.2、2、2 0和2 0 0 m o lL-1)的十七烷酸处理分化第4天的肌管细胞4 8 h,然后利用实时荧光定量 P C R检测十七烷酸对4种肌管肌纤维类型标记基因表达水平的影响,发现M y HC I基因mR NA表达水平随着代谢物处理浓度的升高而显著提高,其它基因mR NA的表达量没有发生显著变化(图9)。推测,十七烷酸可能通过改变M y HC I的表达提高了其背最长肌的红度值。3 讨 论日粮纤维在过去一直被认为是一种抗营养因子,随着研究的深入,越来越多的学者认识到日粮纤5673畜 牧 兽 医 学 报5 4卷 图中的右侧为代谢物名称,底部为不同的肉质表型,图中每个格子表示两个属性(代谢物与肉质表型)之间的相关性,不同颜色代表属性间相关系数的大小。L表示亮度,a表示红度,b表示黄度,D L表示滴水损失,p H表示背最长肌的酸度。*.P0.0 5T h e r i g h t s i d e o f t h e f i g u r e i s t h e n a m e o f m e t a b o l i t e,a n d t h e b o t t o m i s t h e m e a t q u a l i t y p h e n o t y p e s.I n t h e f i g u r e,e a c h g r i d r e p r e s e n t s t h e c o r r e l a t i o n b e t w e e n t w o f e a t u r e s(m e t a b o l i t e a n d m e a t q u a l i t y p h e n o t y p e s),a n d d i f f e r e n t c o l o r s r e p r e-s e n t t h e m a g n i t u d e o f c o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t b e t w e e n f e a t u r e s.L i s b r i g h t n e s s,a i s r e d n e s s,b i s y e l l o w,D L i s d r i