基于系统生物学分析探究热应激诱导鸡肠道损伤的作用机制.pdf

4期969基于系统生物学分析探究热应激诱导鸡肠道损伤的作用机制殷斌1，2，3，隽昌宁1，秦雨2，钟诚2，赵增成1，黄中利1，沈涛3，周慧爽4，郑乾坤2*，林树乾1*（1山东省农业科学院家禽研究所，山东济南250023；2得利斯集团有限公司，山东潍坊262216；3山东大学药学院，山东济南250023；4山东农业大学动物科技学院，山东泰安271018）摘要：【目的】利用系统生物学分析和鸡胚十二指肠上皮细胞模型探究热应激诱导肠道损伤的作用机制，筛选出家禽热应激诱导肠道损伤的作用靶标，为缓解热应激诱导的肠细胞氧化应激提供理论支撑。【方法】基于NCBI数据库筛选热应激诱导肠道损伤的作用靶标，通过GO功能注释和KEGG信号通路富集分析获得相关代谢通路；分离鸡胚十二指肠上皮细胞构建42 热应激模型，通过检测细胞损伤病理、细胞活性、乳酸脱氢酶（LDH）活性、抗氧化酶活性、丙二醛（MDA）含量及关键基因（Nrf2和HSP70）表达情况等，进一步确认热应激对肠细胞的损伤作用。【结果】将热应激作用靶标与肠道损伤作用靶标取交集，共获得23个热应激诱导肠道损伤的作用靶标，分别是BCL2、CD4、CFTR、ERN1、FOXM1、FOXP3、HMOX1、HSF1、HSP90AA1、HSP70、HSPA4、HSPA8、JUN、MAPK1、MTOR、NFKB1、NLRP3、PLK1、RHOB、SIRT1、SUMO2、TP53和YAP1。KEGG信号通路富集分析发现热应激诱导肠道损伤与NOD-样受体信号通路、沙门氏菌感染、凋亡、细胞衰老及内质网内蛋白加工等有关；GO功能注释分析发现热应激诱导肠损伤与细胞缺氧反应、细胞对镉离子反应、细胞对热反应及热休克蛋白结合等有关。鸡胚十二指肠上皮细胞体外热应激模型验证发现，热应激能导致鸡胚十二指肠上皮细胞空泡变性，严重时则导致细胞核浓缩深染的变性坏死；热应激还会引起鸡胚十二指肠上皮细胞的活性降低，而细胞上清液中的LDH含量升高；此外，随着热应激时间的延长，鸡胚十二指肠上皮细胞内的MDA含量不断上升，而超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和过氧化氢酶（CAT）的活性收稿日期：2023-02-24基金项目：山东省自然科学基金项目（ZR2020QC194）；山东省科技型中小企业创新能力提升工程项目（2021TSGC1271，2021TS-GC1275，2022TSGC1056）通讯作者：郑乾坤（1975-），https:/orcid.org/0009-0004-4548-8123，高级畜牧师，主要从事肉质产品评价研究工作，E-mail：；林树乾（1979-），https:/orcid.org/0000-0001-7134-022X，博士，副研究员，主要从事新兽药开发研究工作，E-mail：第一作者：殷斌（1988-），https:/orcid.org/0000-0002-4572-7735，博士，主要从事中兽药研发及抗应激药物研究工作，E-mail：南方农业学报Journal of Southern Agriculture2023，54（4）：969-981ISSN 2095-1191；CODEN NNXAABhttp:/DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.04.001优秀青年学者论坛殷斌（1988-），博士，主要从事中兽药研发及抗应激药物研究工作。主持山东省自然科学基金青年项目“Nrf2-ARE和HSF1-HSE在茶多酚缓解心肌细胞热损伤中的激活和相互作用研究”和山东省科技型中小企业创新能力提升工程项目“防治家禽呼吸道疾病的中兽药制剂研发与技术推广”，作为主要成员参与国家自然科学基金项目3项。在 Cell Stress andChaperones European Journal of Drug Metabolism and PharmacokineticsResearch in Veterinary Science 南方农业学报 等期刊发表学术论文16篇，其中SCI论文9篇；荣获山东省科技进步奖二等奖、齐鲁农学科技奖、中国技术市场金桥奖、中国商业联合会科学技术奖等奖项；以第一完成人获国家发明专利1项，参与获得国家发明专利3项、实用新型专利3项。54卷南 方 农 业 学 报 970均呈下降趋势；热应激导致鸡胚十二指肠上皮细胞内Nrf2基因表达下调、HSP70基因表达上调。【结论】细胞内氧化抗氧化失衡是热应激诱导肠道损伤的重要因素，而热休克蛋白是机体激活细胞抵御热应激损伤的重要保护机制。关键词：鸡；热应激；肠道损伤；氧化损伤；热休克蛋白；系统生物学分析中图分类号：S831.1文献标志码：A文章编号：2095-1191（2023）04-0969-130引言【研究意义】热应激会导致畜禽采食量、生产性能、产品质量及机体免疫力下降，甚至诱发疾病危害，最终导致死亡率增加（宁章勇等，2006；贾先波等，2020）。肠道是营养物质消化吸收的重要场所，也是维持肠道内环境平衡及阻碍致病菌和毒素的先天性屏障。热应激引起的肠道上皮屏障功能受损是造成家禽死亡的重要因素之一（郝贺等，2021）。因此，利用系统生物学分析和鸡胚十二指肠上皮细胞模型探究热应激诱导肠道损伤的作用机制，可为缓解肠道热损伤提供药物治疗的作用靶标。【前人研究进展】热应激是指机体遭受环境温度超过等热区上限的高温度刺激时产生一系列非特异性反应，也称为热应激反应。家禽养殖的等热区温度一般为1027，在全球气候变暖的影响下，越来越多的地区夏季温度逐渐高于等热区温度（Tokarska et al.，Exploring the mechanism of heat stress-induced intestinalinjury in chickens based on systems biology analysisYIN Bin1，2，3，JUAN Chang-ning1，QIN Yu2，ZHONG Cheng2，ZHAO Zeng-cheng1，HUANG Zhong-li1，SHEN Tao3，ZHOU Hui-shuang4，ZHENG Qian-kun2*，LIN Shu-qian1*（1Poultry Research Institute，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Jinan，Shandong 250023，China；2Delisi Group Co.，Ltd.，Weifang，Shandong 262216，China；3School of Pharmaceutical Sciences，ShandongUniversity，Jinan，Shandong 250023，China；4College of Animal Science and Technology，Shandong AgriculturalUniversity，Tai an，Shandong 271018，China）Abstract：【Objective】Based on systems biology analysis and chicken embryo duodenal epithelial cell model，thispaper explored the mechanism of heat stress-induced intestinal injury，to screen the action targets of heat stress-inducedintestinal damage in poultry，and to provide theoretical support for alleviating heat stress-induced oxidative stress inenterocytes.【Method】The NCBI database was used to screen the action targets of heat stress-induced intestinal injury，and the relevant metabolism pathways were obtained by GO functional annotation and KEGG signaling pathway enrich-ment analysis.Chicken embryo duodenal epithelial cells were separated to construct the heat stress model at 42.And byusing pathological detection，cell activity，lactate dehydrogenase（LDH）activity，antioxidant enzyme activity，malon-dialdehyde（MDA）content and expression of key genes（Nrf2 and HSP70），the damages of heat stress on intestinal cellswere confirmed.【Result】By taking the intersection of heat stress action targets and intestinal injury action targets，a totalof 23 action targets of heat stress-induced intestinal injury were obtained，including BCL2，CD4，CFTR，ERN1，FOXM1，FOXP3，HMOX1，HSF1，HSP90AA1，HSP70，HSPA4，HSPA8，JUN，MAPK1，MTOR，NFKB1，NLRP3，PLK1，RHOB，SIRT1，SUMO2，TP53 and YAP1.KEGG signaling pathway enrichment analysis found that heat stress-induced intestinal injury were associated with NOD-like receptor signaling pathways，salmonella infection，apoptosis，cellular senescence，and protein processing in the endoplasmic reticulum.GO functional annotation analysis found thatheat stress-induced intestinal injury were related to cell hypoxia response，cellular response to cadmium ion，cell responseto heat，and heat shock protein binding.The heat stress model of chicken embryo duodenal epithelial cells in vitro showedthat heat stress could cause cells vacuolar degeneration and in severe cases cause nucleus concentrated deep staining thatleading degenerative necrosis；heat stress could reduce cell activity of chicken embryo duodenal epithelial cells andincrease LDH content in cell supernatant；in addition，with the prolongation of heat stress，the MDAcontent in the chickenembryo duodenal epithelial cells increased，while the activities of superoxide dismutase（SOD），glutathione peroxidase（GSH-Px）and catalase（CAT）activities showed a decreasing trend；heat stress resulted in down-regulation of Nrf2 geneand up-regulation of HSP70 gene in chicken embryo duodenal epithelial cells.【Conclusion】Intracellular oxidative-antioxi-dative imbalance is an important factor in heat stress-induced intestinal injury，and heat shock proteins are important pro-tective mechanism against heat stress-induced injury.Key words：chicken；heat stress；intestinal damage；oxidative damage；heat shock protein；systems biology analysisFoundation items：Shandong Natural Science Foundation（ZR2020QC194）；Shandong Science and TechnologySmall and Medium-sized Enterprises Innovation Ability Improvement Project（2021TSGC1271，2021TSGC1275，2022TSGC1056）4期9712020）。家禽具有羽毛丰厚、皮肤无汗腺、代谢旺盛、体温高等特点，其机体状态和生产性能极易受高温环境的影响（Nienaber and Hahn，2007；Hosseindoustet al.，2020），通常采取通风降温结合湿帘等措施降低鸡舍温度。但在夏季高温时段，降温系统达到的效果温度仍会导致鸡群处于热应激的亚健康状态，即热应激给家禽养殖业造成的危害已不容忽视（Habashy et al.，2017；Goel，2021）。热应激促使机体交感神经兴奋，致使肠胃蠕动能力降低、消化酶分泌能力减弱及消化酶活性下降，导致肠胃排空时间增加，进而导致动物机体食欲减退，影响其生产性能（温静等，2021；朱树庆和王丽娜，2022）。热应激还会破坏肠道屏障的完整性，引起脂多糖（Lipopoly-saccharide，LPS）或菌群泄露，进而引起全身性炎症（宁章勇等，2006；雷昕，2019）。鲍恩东等（2004）研究发现，热应激会导致肉鸡肠道黏膜上皮细胞脱落、黏膜固有层水肿及肠绒毛断裂等病理变化。宁章勇等（2006）通过电镜扫描发现，热应激会导致肉仔鸡十二指肠、空肠、回肠的肠绒毛碎裂甚至出现大面积脱落，肠绒毛出现局部水肿。Mohyuddin等（2022）研究证实，肠道上皮屏障在热应激的病理生理过程中发挥重要作用。热应激诱导肠道损伤的原因主要有：（1）在热应激条件下，由于大量血液流向体表以增加散热，致使流经肠道的血量减少，引起肠道上皮细胞的缺血和缺氧。肠道上皮细胞缺血缺氧则导致机体产生过多的活性氧物质（Reactive oxygen species，ROS），而ROS会引起细胞内脂质过氧化，造成细胞氧化还原稳态失衡及肠道组织损伤，且其再生能力下降未能及时更新，即肠道是热应激的首要靶器官（Lambert et al.，2002；张瑜等，2021）。（2）热应激会诱导下丘脑垂体轴的激活，导致分泌的皮质酮和促炎因子及诱导下游产生的ROS通过脑肠轴神经元间的连接造成肠道稳态紊乱（Hosseindoust et al.，2022）。（3）热应激引起家禽肠道菌群的失衡，导致包括乳酸杆菌和双歧杆菌在内的有益细菌数量减少，而沙门氏菌和梭状芽胞杆菌等病原菌在肠道中的定殖增加，诱发疾病（Song et al.，2014；Lee et al.，2021）。因此，热应激诱导肠道上皮细胞的过氧化损伤，以及肠黏膜屏障受损造成的肠道内致病菌和内毒素易位，是造成肠道热损伤及家禽死亡的主要原因。【本研究切入点】系统生物学分析是基于大数据生物信息学分析作为工具支撑，以整体理念系统阐明疾病的作用机制，已在抗焦虑、抗抑郁及治疗冠心病上得到应用（黄明峰等，2012；Xu et al.，2013）。近年来，虽有很多学者对热应激诱导肠道损伤进行大量研究（王雪洁和冯京海，2018；余哲琪等，2019；曾怡铭等，2022），但其作用机制尚未明晰，因此亟待通过系统生物学分析探究热应激诱导鸡肠道损伤的作用机制。【拟解决的关键问题】基于系统生物学分析全面阐述热应激诱导肠道损伤的作用机制，并利用鸡胚十二指肠上皮细胞进行体外验证，筛选出家禽热应激诱导肠道损伤的作用靶标，为缓解热应激诱导的肠细胞氧化应激提供理论支撑。1材料与方法1.1试验材料供试SPF鸡胚由山东省农业科学院家禽研究所动物实验中心提供。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；丙二醛（MDA）检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；细胞活性CCK-8检测试剂购自北仁化学科技（北京）有限公司；HE染色所用的苏木素染色液和伊红染色液购自北京索莱宝科技有限公司。1.2肠道损伤相关靶标获取及相互作用网络构建通过NCBI数据库（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的Gene检索模块，收集与肠道损伤相关的作用靶标基因全称及基因简称。将获得的基因导入STRING数据库（https:/string-db.org/cgi/input.pl），通过Organisms选择Gallus gallus获得各靶标间的相互作用关系及对应评分，筛选作用关系评分0.7的相互作用关系即为可信相互作用，导入Cytoscape中构建靶标间的相互作用网络。利用Cytoscape网络分析功能中的Generate style from statistics板块获取网络靶标的自由度、介数、接近中心性及平均最短路径长度等参数信息，并根据自由度由小到大按颜色由黄色到红色进行注释。1.3肠道损伤核心靶标筛选及富集分析在靶标相互作用网络中，自由度、介数、接近中心性及平均最短路径长度是衡量靶标重要性的主要拓扑参数。筛选出自由度、介数、接近中心性均大于或等于1倍中位数，且平均最短路径长度小于或等于1倍中位数的靶标作为肠道损伤相关的核心靶标，然后将核心靶标导入DAVID数据库（https:/david.ncif-crf.gov/），并将物种和基因背景设为Gallus gallus，分别进行GO功能注释和KEGG信号通路富集分析，挖掘肠道损伤相关的主要信号通路，并利用R语言绘制主要信号通路气泡图。1.4热应激诱导肠道损伤作用机制探究通过NCBI数据库（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/）殷斌等：基于系统生物学分析探究热应激诱导鸡肠道损伤的作用机制54卷南 方 农 业 学 报 972的Gene检索板块，查找与热应激相关的疾病靶标。将热应激相关靶标与肠道损伤相关靶标取交集，作为热应激导致肠道损伤的作用靶标。将筛选获得的作用靶标导入DAVID数据库（https:/david.ncifcrf.gov/），将物种和基因背景设为Gallus gallus，分别进行GO功能注释和KEGG信号通路富集分析，挖掘热应激诱导肠道损伤的主要信号通路，并利用R语言绘制主要信号通路气泡图。1.5细胞试验验证1.5.1鸡胚十二指肠上皮细胞分离培养取16日龄SPF鸡胚，以酒精棉球擦拭蛋壳消毒后用镊子敲碎蛋壳并沿气室去掉蛋壳，取出胚体。用眼科剪剖开鸡胚腹腔，完整取出十二指肠，置于D-Hank s溶液中。小心分离去除十二指肠中间的胰腺组织，D-Hank s溶液清洗干净。采用弯头镊小心剥离十二指肠内的肠黏膜，800 r/min离心15 min，收集肠黏膜组织。向肠黏膜组织中加入终浓度为1 mg/mL的胶原酶I，置于细胞培养箱中消化30 min，每隔10 min用微量移液器吹打重新悬浮组织沉淀，待组织消化成单个细胞后加入等量含20%血清的DMEM/F12培养基终止消化。800 r/min离心15 min，收集细胞，再加入含20%血清的DMEM/F12培养基重悬细胞，过200目细胞筛后按1106个/mL的密度进行布板，置于细胞培养箱中培养，24 h后换液备用。1.5.2鸡胚十二指肠上皮细胞热应激模型构建将分离获得的鸡胚十二指肠上皮细胞随机分为对照组和热应激组，待细胞融合度达80%90%时转移至42 细胞培养箱内进行热应激。热应激时间分别设为0、1、5和10 h，热应激结束后立即收集细胞上清液和细胞样品，备用。1.5.3热应激诱导鸡胚十二指肠上皮细胞损伤病理性检测将分离获得的鸡胚十二指肠上皮细胞接种至已放入细胞爬片的24孔细胞板中，热应激处理结束后弃细胞上清液，以PBS清洗后置于4%多聚甲醛中固定，用于HE染色。HE染色步骤：固定好的细胞弃固定液，用PBS清洗细胞爬片2次。以95%乙醇浸泡15 min。使用苏木素染色液对细胞核进行染色，染色5 min后以自来水冲洗掉多余的染液。以1%盐酸酒精处理3 s。用自来水浸泡细胞爬片，复染30 min，复染结束后用吸水纸吸去多余水分。使用伊红染色液对细胞质进行染色，染色5 min后以自来水冲洗掉多余的染液。细胞爬片依次经75%乙醇、95%乙醇、100%乙醇（I）和100%乙醇（II）各脱水处理2 min。细胞爬片置于二甲苯中透明处理2 min。使用中性树脂封片，显微镜下观察并拍照。1.5.4热应激诱导鸡胚十二指肠上皮细胞氧化损伤检测将分离获得的鸡胚十二指肠上皮细胞接种至96孔细胞板中，热应激处理后更换新鲜细胞培养液，每孔添加10 L CCK-8溶液，置于细胞培养箱内孵育2 h，在450 nm波长下测定吸光值以检测细胞活性。同时，将分离获得的鸡胚十二指肠上皮细胞接种于30 mm的细胞培养皿中，热应激处理结束后收集上清液用于LDH活性检测，细胞经PBS清洗后每孔加入不含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液200 L，在4 下裂解10 min，收集裂解液，12000 r/min离心10 min，收集上清液用于MDA含量及SOD、CAT和GSH-Px活性检测。1.5.5热应激对鸡胚十二指肠上皮细胞内Nrf2和HSP70基因表达的影响将分离获得的鸡胚十二指肠上皮细胞接种于30 mm的细胞培养皿中，热应激处理结束后收集细胞提取总RNA，并反转录合成cDNA。根据NCBI已公布Gallus gallus基因序列，采用Primer5.0设计扩增引物（表1），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以实时荧光定量PCR检测氧化应激通路中的关键基因（Nrf2和HSP70），以GAPDH为内参基因，采用2-Ct法换算目的基因相对定量。2结果与分析2.1肠道损伤相关靶标相互作用网络构建情况通过NCBI数据库的Gene检索模块，共收集到631个与肠道损伤（Intestinal damage）相关的作用靶标。将获得的631个作用靶标导入STRING数据库，获得各靶标间相互作用关系评分0.7的共2524条，作为可信相互作用关系；然后导入Cytoscape软件中，利用Cytoscape软件中的网络分析功能对各靶标的自由度、介数、接近中心性及平均最短路径长度进行分析，并根据自由度由小到大按颜色由黄色到红基因 GeneGAPDHNrf2HSP70上游引物 Forward primer5-TGAAAGTCGGAGTCAACGGAT-35-AACGCTGAACCACCA-35-AGCGTAACACCACCATTCC-3下游引物 Reverse primer5-ACGCTCCTGGAAGATAGTGAT-35-TTCCCAAACTTGCTCTAT-35-TGGCTCCCACCCTATCTC-3表 1实时荧光定量PCR扩增引物序列信息Table 1Real-time fluorescence quantitative PCR amplified primer sequence information4期973色进行注释，以获得靶标间相互作用网络（图1）。其中，CTNNB1、STAT3、JUN、CASP3、IL6、GRB2、EGF和EGFR的自由度均大于50，预测是肠道损伤的重要靶标。2.2肠道损伤核心靶标筛选及富集分析结果按自由度、介数及接近中心性均大于或等于1倍中位数且平均最短路径长度小于或等于1倍中位数的核心靶标筛选原则，共筛选出167个核心靶标。将核心靶标导入DAVID数据库进行GO功能注释和KEGG信号通路富集分析，由KEGG信号通路富集气泡图（图2）可看出，肠道损伤的信号通路与Toll样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway）、局部黏附（Focal adhesion）、丝裂原活化蛋白激酶信号通路（MAPK signaling pathway）、C型凝集素受体信号通路（C-type lectin receptor signaling pathway）及FoxO信号通路（FoxO signaling pathway）等有关；由GO功能注释气泡图（图3）可看出，肠道损伤的信号通路与ERK1和ERK2级联的正向调节（Positiveregulation of ERK1 and ERK2 cascade）、凋亡过程的负调控（Negative regulation of apoptotic process）、炎症反应（Inflammatory response）及血管生成（Angio-genesis）等通路关。2.3热应激诱导肠道损伤的作用机制分析结果通过NCBI数据库的Gene检索模块，共收集到46个与热应激相关的作用靶标。将热应激作用靶标与肠道损伤作用靶标取交集，共获得23个热应激诱导肠道损伤的作用靶标（表2），分别是BCL2、CD4、CFTR、ERN1、FOXM1、FOXP3、HMOX1、HSF1、HSP90AA1、HSP70、HSPA4、HSPA8、JUN、MAPK1、MTOR、NFKB1、NLRP3、PLK1、RHOB、SIRT1、SU-MO2、TP53和YAP1。将这些作用靶标导入DAVID数据库进行GO功能注释和KEGG代谢通路富集分析，由KEGG信号通路富集气泡图（图4）可看出，热应激诱导肠道损伤与NOD-样受体信号通路（NOD-likereceptor signaling pathway）、沙门氏菌感染（Salmo-nella infection）、凋亡（Apoptosis）、细胞衰老（Cellu-图 1肠道损伤相关靶标相互作用网络Fig.1Intestinal injury-related target interaction network殷斌等：基于系统生物学分析探究热应激诱导鸡肠道损伤的作用机制54卷南 方 农 业 学 报 974图 2肠道损伤核心靶标的KEGG信号通路富集分析结果Fig.2KEGG signal pathway enrichment analysis of core targets of intestinal injury图 3肠道损伤核心靶标的GO功能注释分析结果Fig.3GO functional annotation analysis of core targets of intestinal injuryKEGG信号通路 KEGG pathwayNumber of core targets102030P0.00160.00120.00080.00042.55.07.510.0富集倍数 Fold enrichmentGO功能条目 GO term0204060核心靶标数量 Number of core targets生物过程Biological process细胞组分Cellular components分子功能Molecular function4期975lar senescence）及内质网内蛋白加工（Protein pro-cessing in endoplasmic reticulum）等有关；由GO功能注释气泡图（图5）可看出，热应激诱导肠损伤与细胞缺氧反应（Cellular response to hypoxia）、细胞对镉离子反应（Cellular response to cadmium ion）、细胞对热反应（Cellular response to heat）及热休克蛋白结合（Heat shock protein binding）等有关。2.4细胞试验验证结果2.4.1鸡胚十二指肠上皮细胞分离培养效果鸡胚十二指肠上皮细胞培养过程见图6。采用弯头镊剥离的鸡胚十二指肠组织可清析观察到小肠绒毛单位（图6-A和图6-B），经胶原酶I消化后可见单个的小肠上皮细胞（图6-C和图6-D），置于细胞培养箱培养24 h后可观察到贴壁生长、呈椭圆状的鸡胚十二指肠上皮细胞（图6-E和图6-F）。2.4.2热应激诱导鸡胚十二指肠上皮细胞的病理性损伤通过HE染色评估热应激对鸡胚十二指肠上皮细胞的病理性损伤，结果（图7）显示，在热应激1 h后鸡胚十二指肠上皮细胞出现轻微的空泡变性（），热应激至5 h时其空泡变性增强，热应激至10 h时鸡胚十二指肠上皮细胞的细胞核出现因核浓缩而导致的细胞核深染现象（）。表 2热应激诱导肠道损伤的作用靶标Table 2Targets of intestinal injury induced by heat stress靶标符号 Target symbolBCL2CD4CFTRERN1FOXM1FOXP3HMOX1HSF1HSP90AA1HSP70HSPA4HSPA8JUNMAPK1MTORNFKB1NLRP3PLK1RHOBSIRT1SUMO2TP53YAP1靶标英文注释 English name of targetBCL2 apoptosis regulatorCD4 moleculeCystic fibrosis transmembrane conductance regulatorEndoplasmic reticulum to nucleus signaling 1Forkhead box M1Forkhead box P3Heme oxygenase 1Heat shock transcription factor 1Heat shock protein 90 alpha family classAmember 1Heat shock protein 70Heat shock protein familyAmember 4Heat shock protein familyAmember 8JUN proto oncogene，AP 1 transcription factor subunitMitogen activated protein kinase 1Mechanistic target of rapamycin kinaseNuclear factor kappa B subunit 1NLR family pyrin domain containing 3Polo like kinase 1ras homolog family member BSirtuin 1Small ubiquitin like modifier 2Tumor protein p53Yes1 associated transcriptional regulator靶标中文注释 Chinese name of targetBCL2凋亡调节因子CD4分子囊性纤维化跨膜电导调节剂内质网至细胞核信号传导1叉头框蛋白M1叉头框蛋白P3含铁血红素氧合酶-1热休克转录因子1热休克蛋白90 alpha热休克蛋白70热休克蛋白家族A4成员热休克蛋白家族A8成员JUN原癌基因，AP 1转录因子亚基丝裂原激活蛋白激酶1雷帕霉素激酶靶标核因子B亚基1含pyrin结构域NOD样受体家族3Polo样激酶1ras同系物家族成员B去乙酰化酶1小泛素像修饰剂2肿瘤蛋白p53Yes1相关的转录调节因子图 4热应激诱导肠道损伤作用靶标的KEGG信号通路富集分析结果Fig.4KEGG signal pathway enrichment analysis of the targets of intestinal injury alleviated by heat stressNumber of targetsP0.080.060.040.023.03.54.04.55.0富集倍数 Fold enrichment6810KEGG信号通路 KEGG pathway殷斌等：基于系统生物学分析探究热应激诱导鸡肠道损伤的作用机制54卷南 方 农 业 学 报 976图 5热应激诱导肠道损伤作用靶标的GO功能注释分析结果Fig.5GO functional annotation analysis of the targets of intestinal injury alleviated by heat stress图 6原代鸡胚十二指肠上皮细胞培养过程Fig.6Primary duodenal cell culture processA：未消化的鸡胚十二指肠（100）；B：未消化的鸡胚十二指肠（250）；C：消化后的鸡胚十二指肠上皮细胞（100）；D：消化后的鸡胚十二指肠上皮细胞（250）；E：贴壁生长的鸡胚十二指肠上皮细胞（100）；F：贴壁生长的鸡胚十二指肠上皮细胞（250）A：Undigested duodenum of chicken（100）；B：Undigested duodenum of chicken（250）；C：Epithelial cells after duodenal digestion of chicken（100）；D：Epithelial cells after duodenal digestion of chicken（250）；E：Adherent duodenal epithelial cells of chicken（100）；F：Adherentduodenal epithelial cells of chicken（250）051015ACEBDFGO功能条目 GO term靶标数量 Number of targets生物过程Biological process细胞组分Cellular components分子功能Molecular function4期9772.4.3热应激诱导鸡胚十二指肠上皮细胞氧化损伤检测结果CCK-8检测结果（图8-A）显示，热应激1 h后鸡胚十二指肠上皮细胞活性已极显著降低（P0.01，下同），至热应激10 h时其细胞活性仅为热应激前（0 h）的68%。LDH测定结果（图8-B）表明，热应激1 h后鸡胚十二指肠上皮细胞上清液中的LDH活性显著升高（P0.05）。在鸡胚十二指肠上皮细胞内MDA含量（图8-F）方面，热应激1 h后细胞内MDA含量开始显著升高，至热应激10 h时MDA含量极显著升高，约是热应激前（0 h）的2.36倍。2.4.4热应激对鸡胚十二指肠上皮细胞内Nrf2和HSP70基因表达的影响实时荧光定量PCR检测结果（图9）表明，热应激引起鸡胚十