基于文库筛选的方法确定SPINT3与胃腺癌转移之间的关联.pdf

兰州大学学报（自然科学版），2 0 2 3，59(3）/6 月Journal of Lanzhou University(Natural Sciences),2023,59(3)/June基于文库筛选的方法确定SPINT3与胃腺癌转移之间的关联汪海锋，王浩浩，滕理送1.宁波市北仑区人民医院（浙江大学医学院附属第一医院北仑分院）肿瘤外科，浙江宁波3158 0 02.浙江大学医学院附属第一医院完肿瘤外科，杭州310 0 0 3摘要：通过胃腺癌肺转移模型确定SPINT3与胃癌转移之间的相关性.结果表明，SPINT3sgRNA在胃腺癌肺部转移中的表达均为阳性；SPINT3的表达与转化生长因子1(TGF1)的分泌密切相关.检测SPINT3与肿瘤细胞的调亡、增殖、迁移、体内转移能力和肿瘤相关通路的关联，SPINT3在MKN-45细胞中的过表达能够促进肿瘤细胞的调亡，抑制增殖与迁移.SPINT3的抑制促进了MKN-45的体内转移能力，SPINT3的表达特异性的调节了TGF1通路.通过药物筛选确定了SPINT3的低表达能够被阿帕替尼和SB431542所逆转，这两种药物能够促进MKN-45SPINT3shRNA的调亡，阻断体内转移.关键词：TGF1结合通路；SPINT3；胃腺癌；肿瘤转移中图分类号：R735.2文献标识码：A文章编号：0 455-2 0 59(2 0 2 3)0 3-0 40 6-0 9D0I:10.13885/j.issn.0455-2059.2023.03.016Association between SPINT3 and gastric adenocarcinomametastasis was determined by library screeningWANG Hai-feng,WANG Hao-hao,TENG Li-song?1.Department of Surgical Oncology,the Peoples Hospital of Beilun District,Beilun Branch Hospital of theFirst Affiliated Hospital,Zhejiang University School of Medicine,Ningbo 315800,Zhejiang,China2.Department of Surgical Oncology,the First Affiliated Hospital,Zhejiang University School ofMedicine,Hangzhou 310003,ChinaAbstract:A correlation between SPINT3 and gastric cancer metastasis was determined via the lung me-tastasis model of gastric adenocarcinoma,the expression of SPINT3 sgRNA was positive in lung metas-tasis nodules and the expression of SPINT3 was closely related to the secretion of TGF1.The relation-ship was detected between SPINT3 and apoptosis,proliferation,migration,in vivo metastasis and tumorrelated pathways.The results showed that the overexpression of SPINT3 in MKN-45 cells could promotethe apoptosis,inhibit proliferation and migration of tumor cells,while the inhibition of SPINT3 promotedthe in vivo metastasis ability of MKN-45,and SPINT3 specifically regulated the TGF1 pathway.Through drug screening,it was determined that the low expression of SPINT3 could be reversed by Apa-tinib and SB431542,which could promote the apoptosis of MKN-45 SPINT3 shRNA and block metasta-sis invivo.Key words:TGF1 binding pathway;SPINT3;gastric adenocarcinoma;tumor metastasis收稿日期：2 0 2 2-0 3-31修回日期：2 0 2 2-0 6-13基金项目：国家自然科学基金项目（8 17 7 2 8 53）作者简介：汪海锋(198 5-),男，绍兴上虞人，副主任医师，e-mail:，研究方向为肿瘤化疗、靶向及生物治疗；滕理送(196 2-),男，温州永嘉人，主任医师，博士,e-mail:；研究方向为肿瘤的生物治疗、分子靶向治疗及个体化治疗，通信联系人：407汪海锋，等：基于文库筛选的方法确定SPINT3与胃腺癌转移之间的关联胃癌在中国的癌症发病率和死亡率中排名前列.2 0 15年中国胃癌的新发病例为40.3万例，死亡病例达2 9.0 9万人，其中农村人口中的发病率为15.84例/10 万人，城市人口中的发病率为11.0 5例/10万人 2.胃腺癌的发病机制十分复杂，除与遗传易感性、基因组不稳定性 4、微卫星不稳定性、染色体不稳定性等生物学事件显著相关外，在癌细胞的发生、发展过程中也伴随多种抑癌基因如P5317、钙依赖性细胞吸附蛋白1(CDHI)等 8 的突变缺失，癌基因如人类表皮生长因子受体2(HER2)9、成纤维生长因子受体2(FGFR2)的异常激活等。尽管随着早期筛查、多种联合治疗手段的应用，胃腺癌的发病率和病死率一直稳步下降，但出现远隔器官转移的胃腺癌患者5年生存率骤降至不足10%l.因此寻找胃腺癌转移过程中的驱动基因成为当前研究的热点。胃腺癌转移过程中转化生长因子-1(TGF1)是已知的能够调节转移的细胞因子.在肿瘤转移的起始过程中，微环境中的TGF1表达能够招募多种免疫细胞，如骨髓来源抑制性细胞(myeloid-derived suppressorcell,MDSC)、肿瘤相关巨噬细胞等12.这些细胞能分泌多种细胞因子如白介素10(IL-10)、白介素8(IL-8),促进肿瘤细胞的增殖和侵袭(3.有学者尝试明确肿瘤微环境中TGF1分泌增加的机制，如YANG等141通过敲除TGF1结合通路中的基因LTBP4,使得肿瘤细胞的TGF1分泌显著增加，提高了肿瘤微环境中MDSC的比例，促进了肝癌的转移.在胃腺癌的早期转移中，TGF1已被证实与肿瘤细胞的转移相关 15,但由于TGF1的作用范围十分广泛，仅在胃癌中其可能的机制就包括细胞分化、增殖、形态改变、细胞外基质产生、调亡等6，涉及的信号通路包括SMAD3、S MA D 2、S MA D 7、S T A T 1、MA P K、NF-kB等17,因此仅应用TGF1抑制剂并不能取得很好的效果 18 目前尚未有研究明确TGF1结合通路与胃腺癌转移之间的关联，明确TGF1促进癌细胞转移的分子机制，有助于肿瘤转移的早期诊断和相应的靶向治疗药物的开发。SPINT3(serine peptidase inhibitor,Kunitz Type3)基因于2 0 11年被发现，其功能可能与丝氨酸型内肽酶抑制剂活性、受体拮抗剂活性、TGF1结合相关.目前关于SPINT3的研究相对较少，且多数集中于单基因研究，无法从整体水平观察通路变化对胃腺癌转移的影响，其与胃癌之间的关联尚未有报道，本研究用动物模型通过文库筛选的方式明确胃腺癌转移的相关通路，论证TGF1结合通路中的SPINT3与胃腺癌转移之间的关联.1材料与方法1.1细胞培养与胃腺癌样本所用细胞为2 93t、MK N-45、小鼠前胃癌细胞(mouse forestomach carcinoma,MFC)细胞.2 93t与MKN-45细胞培养于DMEM高糖完全培养基（含10%胎牛血清FBS)中；MFC细胞培养于RPMI-1640完全培养基（含10%FBS)中，培养条件均为37,空气中CO,体积分数5%.6 例胃腺癌肿瘤组织及其对应的癌旁组织来自浙江大学第一附属医院，所有样本均有患者签署的知情同意书，实验流程得到浙江大学第一附属医院伦理委员会批准。1.2文库筛选选用的sgRNA文库主要包括GO:0050431通路，为TGF1结合蛋白通路，其中包括2 2 个基因，均与TGF1的分泌、调节相关，根据这2 2 个基因设计了6 6 个sgRNA(每个基因设计3个sgRNA靶向).该文库由中国金唯智苏州分公司合成，骨架质粒为Lentiv2.在得到亚文库后，将该文库与慢病毒包装辅助质粒pMD2.G、p s P A X 2 载体按照4:1:3的比例混合，转染至2 93t细胞中，收取48 h的病毒上清液.使用病毒上清液感染MKN-45细胞系48 h,并使用嘌呤霉素(4g/mL)筛选48 h后，得到文库感染的MKN-45.将MKN-45感染Lentiv2空载体作为对照，图1为文库组和对照组小鼠的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的荧光强度。本研究中所用小鼠包括裸鼠与严重免疫缺陷(severe combined immunodeficiency,SCID)小鼠,购自北京维通利华有限公司.模型构建结束后，收取SCID小鼠胃部原位肿瘤及肺部转移肿瘤，提取DNA，试剂盒为血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（天根生化(北京)科技公司，DP304).基因组DNA使用sgRNAForward与Lentiv2R(F-5-GAGCCAGTACACGACATCAC-3-R)扩增，并使用凝胶电泳检测sgRNA的表达.1.3细胞分组分组包括对照组(CON)、S P INT 3s g R NA 及CON、S P INT 3过表达组.在CON与SPINT3sgRNA组中，细胞分别感染CON和SPINT3sgRNA慢病毒上清液或转染CON与SPINT3sgRNA慢病毒载408兰州大学学报（自然科学版），2 0 2 3，59(3)3mmmma对照组2.5mm2.5mmb文库组图1小鼠肺部细胞的GFP荧光强度Fig.1GFP fluorescence intensity of mouse lung cells体（使用lipofectamine2000转染，购自美国Invit-rogen公司，货号116 6 8 0 30).CON为Lentiv2载体，SPINT3 sgRNA序列为GTCAAACCTACATGACGCGA.在CON与SPINT3过表达组中，MKN-45与MFC细胞系分别转染或感染人或小鼠SPINT3过表达载体.以上两种载体均由中国华大基因公司合成，骨架质粒为pCDH-EF1-MCS-T2A-GFP（美国System Biosciences(SBI)公司,CD526A-1).1.4通路富集分析在通路富集分析中，选取数据集为癌症基因组图谱-胃腺癌(cancer genome atlas-stomach ad-enocarcinoma，T CG A-S T A D)数据集，使用R软件进行分析.数据集用GDCRNATools下载标准化后，用org.Hs.eg.db注释，并提取出GO:0050431(TGF1结合通路)通路中的基因.将TCGA-STAD数据集中的样本按照SPINT3的均值分为低表达与高表达组，使用Limma包进行差异分析，其中P1均被认为是差异表达基因，用ClusterProfile进行通路富集分析.1.5免疫印迹通过Westernblot方法实现：通过研钵磨碎组织，用RIPA裂解液裂解，细胞直接用RIPA裂解液裂解，裂解时间30 min.裂解液加人相应体积的上样缓冲液，沸水浴10 15min后，加至十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳胶中，12 0 V恒压直至溴酚蓝跑至胶板底部.将蛋白以30 0 mA恒流的方式转至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidenefluoride,PVDF)上，用5%牛血清白蛋白(BSA)室温封闭1h,PVDF膜4过夜标记一抗.本研究中SPINT3抗体由上海碧云天公司合成，其余抗体包括甘油醛3磷酸脱氢酶(GAPDH,ab8245)、T G F-1(ab215715)、TGF-type 1 receptor(ab31013)、T G F-type 2 re-ceptor(ab186838)、S MA D 3、p-S MA D 3(a b 52 90 3)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、g a m a(a b 154598)、PI3K-p85(ab191606)、p-磷酸化受体丝氨酸/苏氨酸激酶1(AKT1)(Ser473)(ab81283)、磷酸化有丝分裂原活化蛋白激酶1(p-MEK1)(ab96379)、糖原合成酶激酶-3(t-GSK3)(ab93926)、-catenin(ab32572)均购自美国Abcam公司.t-MEK1(12761)p-GSK3(Ser9)(9322)、p-catenin(Ser 33,37)(9651)磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)(4370)、t-ERK1/2(4695)购自美国Cell Signaling Technology(CST)公司.抗体稀释质量比除SPINT3为1:2 0 0,GAPDH为1:50 0 0 外，其余均为1:10 0 0.PVDF膜用含0.1%Tween20的磷酸盐吐温缓冲液(phos-phate buffer solution,PBS)清洗3次后，标记相应种属的二抗，抗体稀释质量比为1:50 0 0，室温孵育二抗30 min后，使用PBS(含0.1%Tween20)清洗3次.加人增强化学发光底物并通过CCD扫描仪(美国Bio-Rad公司，ChemiDoc)检测蛋白水平的表达改变.1.6细胞凋亡、增殖与迁移细胞调亡：使用膜联蛋白5-别藻青蛋白(An-nexinVAPC)/碘化丙啶(PI)双染法检测.检测试剂盒购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号P-CA-207.细胞消化后，用原培养上清液终止消化，用PBS清洗3次.细胞使用结合缓冲液重悬，加人AnnexinVAPC抗体与PI染料，室温避光标记10min后，用流式细胞仪检测细胞调亡的变化.细胞增殖：用细胞计数试剂盒-8(日本同仁化学研究所，CK-04)法检测.细胞首先铺于96 孔板中，每孔30 0 0 个细胞，设立4副孔，并分别在0、24、48、7 2、96 h 加人1/10 体积的CCK-8试剂，37避光孵育3h后，用酶标仪检测450 nm光密度，最终细胞的增值指数=(其余时间点的450 nm光密度)/(0 h时的450 nm光密度).细胞迁移：细胞首先铺于2 4孔板中，每孔2 10个细胞，待细胞贴壁后，使用白枪尖水平做一划痕，并于0、12 h时拍照。1.7细胞与动物药物实验在药物处理的体外实验中，MKN-45分为CON、阿帕替尼组、SB431542组，并铺于2 4孔板中，血清饥饿12 h后，分别加人同等体积的DMSO、409汪海锋，等：基于文库筛选的方法确定SPINT3与胃腺癌转移之间的关联25mol/L阿帕替尼与1mol/L的SB431542,37+体积分数5%CO,环境下培养7 2 h，并收取蛋白.15只裸鼠在尾静脉注射110 个MKN-45SPINT3shRNA细胞后，随机分为CON、阿帕替尼与SB431542组，并在细胞注射7 d后分别腹腔注射同等体积PBS、50 m g/k g 阿帕替尼、10 0 L1mol/L的SB431542.每7 d注射2 次，共14d,21d后解剖小鼠，使用荧光显微镜检测小鼠肺部转移肿瘤的变化。1.8统计学分析使用公共数据库R(4.0.5版本)软件完成，其余统计学分析使用SPSS20.0完成，其中小鼠肺部GFP信号强度、增殖指数差异分析的数据使用独立样本t检验分析，P0.05即认为差异具有统计学意义.2结果为明确TGF1分泌相关通路中与胃腺癌转移相关的基因，建立动物模型，将MKN-45标记绿色荧光蛋白，同时感染包含6 6 个sgRNA的慢病毒(靶向2 2 个TGF1结合相关基因)，在感染病毒48h后，细胞使用嘌呤霉素筛选48 h，并注射人裸鼠皮下，待14d后，裸鼠形成原位肿瘤，收取原位肿瘤组织，植入SCID小鼠胃部皮下，待12 周后，处死各组小鼠，检测小鼠胃部、肺部肿瘤组织中sgRNA的表达(图2、3).用该模型证实了文库组中小鼠肺部癌细胞转移显著增加，表明在TGF1结合相关基因中，存在着与胃腺癌转移相关的基因.用聚合酶链式反应(polymerasechain reaction,PCR)检测小鼠肺部转移组织中sgRNA的表达结果表明SPINT3sgRNA在文库组小鼠肺部转移肿瘤中普遍表达，VASN(Vasorin)、扭曲原肠胚形成同源物1(TWSGI)在肺部肿瘤组织中也有表达(图4),其他sgRNA在肺部转移肿瘤中缺失.因此，可初步判定SPINT3的表达可能与胃腺癌的转移相关.在TCGA数据库中，将胃腺癌组织分为SPINT3低表达与高表达组，通过GO分析检测在低表达组的组织中通路富集的改变.在SPINT3低表达组中，TGF1分泌相关通路高度富集(图5),表明SPINT3的功能与TGF1的分泌相关.在样本中选取6 例胃腺癌组织及其对应的癌旁组织，发现SPINT3在胃腺癌组织中的表达显著降低，进一步说明SPINT3可能为抑癌基因(图6).60*4020对照组文库组图2对照组与文库组小鼠的生物学重复统计Fig.2Statistical analysis of biological replicationof control and library miceSPINT3SgRNAVASNSgRNA-TWSGISgRNA-图3PCR检测文库组小鼠肺部转移肿瘤中SPINT3、VASN、T WS G IS g R NA 的表达Fig.3Detection of SPINT3,VASN,TWSGI sgRNAexpression by PCR detectionACVRIACVRLICD109CD36ENGHYAL2ITGAVLRRC32LTBPILTBP3LTBP4NRROSSPINT3TGFB3TGFBRITGFBR2TGFBR3THBSITWSGIVASNWFIKKNIWFIKKN2中原小小台0 1小台1台66二出现缺失图412只文库组小鼠中各种sgRNA出现的频率Fig.4The frequency of various sgRNAs appearing in12 librarygroupmice为进一步明确SPINT3的功能，设计了SPINT3过表达与敲除载体，并转染至MKN-45细胞系中，通过westernblot证实了SPINT3过表达与敲除载410兰州大学学报(自然科学版)，2 0 2 3，59(3)TGF分泌通路TGFB激活通路细胞周期相变调节P有丝分裂姐妹染色单体分离染色体分离5.0e-14核分裂1.0e-131.5e-13细胞周期负向调控2.0e-13核染色体分离染色体分离的调节有丝分裂细胞周期的负调节020406080富集通路中的基因数目aSPINT3低表达肿瘤样本中富集的通路3200200400600800富集通路总体排序bTGF分泌通路排序柱状图0.30.20.100200400600800富集通路总体排序CTGF分泌通路排序折线图图5SPINT3相关通路在TCGA数据库中SPINT3低表达与高表达组胃腺癌组织中通路的富集Fig.5SPINT3 related pathway in TCGA database,enrich-ment of pathway in stomach adenocarcinoma tissuewhich have SPINT3 low and high expression癌旁组织胃腺癌组织SPINT310kDGAPDH38kD图6SPINT3在各组织中蛋白水平的表达Fig.6Expressionof SPINT3proteinlevels invarious tissues体能够分别在蛋白水平促进与抑制SPINT3的表达(图7).用AnnexinVAPC/PI双染法检测MKN-45CON、MK N-45S P INT 3细胞的凋亡水平变化，发现SPINT3的过表达使MKN-45的调亡水平显著提升(图8).裂解Caspase3在MKN-45SPINT3细胞中的表达显著升高，表明SPINT3的过表达能够通过Caspase3蛋白促进细胞调亡(图9).SPINT3的表达也抑制了MKN-45的增殖与迁移(图10、11).通过模型证实了SPINT3的抑制能够大幅提升MKN-45体内转移的能力（图12、13),在MKN-45CON组中，小鼠肺部未出现含有绿色荧光蛋白的肿瘤细胞，说明未发生肿瘤细胞肺部转移.结果表明SPINT3在胃腺癌中以抑癌基因的方式发挥作用，且其表达能够全面调节胃腺癌细胞系的生物MKN-45MKN-45CONSPINT3SPINT310kDGAPDH38kDa在MKN-45CON与MKN-45SPINT3细胞中MKN-45MKN-45CONSPINT3SgRNASPINT310kDGAPDH38kDb在MKN-45CON与MKN-45SPINT3sgRNA细胞中图7SPINT3蛋白水平过表达与敲除载体的验证Fig.7Verification of SPINT3 protein overexpressionandknockoutvectorQ1Q210*0010Id:H-TE1010Q4Q396.1%3.91%101010101010*AnnexinVAPCaMKN-45CONQ1Q2100010三1010Q4Q370.3%29.5%1010101010104AnnexinVAPCbMKN-45SPINT3图8SPINT3对细胞调亡的影响Fig.8Effectof SPINT3oncellsapoptosis411汪海锋，等：基于文库筛选的方法确定SPINT3与胃腺癌转移之间的关联MKN-45CONMKN-45.SPINT319kD裂解Caspase317kDaMKN-45CONGAPDH38kDbMKN-45SPINT3图9SPINT3对调亡标记物的影响Fig.9Effect of SPINT3onapoptosis markers8-MKN-45CONMKN-45SPINT364*工2工工1024487296时间/h图10SPINT3对细胞增殖的影响Fig.10Effect of SPINT3 on cell proliferationMKN-45CONMKN-45SPINT3oh12h图11SPINT3对细胞迁移的影响Fig.11Effect of SPINT3 on cell migrationf学特性。通过基因通路富集分析已经证实SPINT3的表达可能调节TGF1分泌相关通路，因此分别在MKN-45与MFC细胞系中过表达SPINT3基因(图14)，系统性地检测PI3K/AKT1/MEK1/GSK3/-catenin/ERK通路在蛋白水平的改变.结果表明以上通路均未受到SPINT3的影响(图15),而TGF1的表达在SPINT3过表达后显著下调，相应的下游通路SMAD3磷酸化受限，SMAD3整体的表达下mm2.5mm2.5mmaMKN-45CON转移前bMKN-45SPINT3sgRNA转移前CMKN-45SPINT3sgRNA转移后图12 MKN-45CON与MKN-45SPINT3sgRNA体内转移能力的比较Fig.12Comparison of the metastasis ability of MKN-45 CON and MKN-45 SPINT3 sgRNA in vivo100*806040200CONSPINT3SgRNA图13SPINT3与转移关联的统计学分析Fig.13Statistical analysis of SPINT3 and metastasis调（图16).这些结果证实了SPINT3的表达特异性地调节了TGF1通路.在明确了SPINT3的表达对胃腺癌转移的调节MKN-45MKN-45MFCMFCCONSPINT3CONSPINT3SPINT310kDGAPDH38kD图14SPINT3在蛋白水平的过表达载体的验证Fig.14Validation of SPINT3 overexpression vectorat the protein level412兰州大学学报（自然科学版），2 0 2 3，59(3）MKN-45MKN-45MFCMFCCONSPINT3CONSPINT3PI3K-gamma126kDPI3K-p8584kDp-AKT1(Ser473)56kDt-AKT156kDt-MEK143kDp-MEK1(Ser298)43kDp-GSK3(Ser9)47 kDt-GSK347kDaSPINT3对PI3K/AKT通路以及MEK/GSK3通路活性的影响MKN-45MKN-45MFCMFCCONSPINT3CONSPINT3-catenin86kDp-catenin(Ser33,37)85kD44kDp-ERK1/242kDt-ERK1/244kD42kDGAPDH38kDbSPINT3对-catenin通路以及ERK通路活性的影响图15SPINT3与已知肿瘤细胞相关通路在蛋白水平的表达Fig.15Expression of SPINT3 and known tumorcell related pathways at protein levelMKN-45MKN-45CONSPINT3TGF-113kDTGF-1 typel56kD受体TGF-1 type265 kD受体P-SMAD348kD(S423+S425)t-SMAD348kDGAPDH38kD图16SPINT3与TGFBI通路的关联Fig.16Correlation between SPINT3 and TGF1 pathway后，本研究尝试使用药物处理的方式阻断该转移.在胃腺癌靶向治疗药物中发现阿帕替尼的处理能够显著上调SPINT3的表达，另一种TGF1抑制剂SB431542也能显著上调SPINT3的表达.通过这两种药物的处理，SPINT3的表达可能会被逆转，从而抑制肿瘤细胞的转移(图17).通过检测阿帕替尼与SB431542处理后的细胞调亡的改变，发现两种药物均能诱导MFCSPINT3shRNA细胞的凋亡(图18).图19、2 0 进一步证实阿帕替尼与SB431542能够阻断SPINT3抑制诱导的体内转移增加，在阿MKN-45SPINT3阿帕替尼SB431542ShRNASPINT310kDGAPDH38kD图17药物处理后MKN-45SPINT3shRNA细胞中SPINT3在蛋白水平的表达Fig.17Expressionof SPINT3inMKN-45SPINT3shRNAcells in protein level after drug treatmentQ1Q210*4.27%1.73%10三10 1004Q394.0%010LLLLLLL1010101010*AnnexinVAPCaMKN-45SPINT3shRNALLLQ110*Q21.49%18.3%10LLLLLIE1010Q376.493.78%10101010210AnnexinVAPCb阿帕替尼Q110*Q21.71%15.5%10E1010Q377.0%5.72%1010101010AnnexinVAPCCSB431542图18SPINT3过表达细胞对靶向治疗药物的敏感程度Fig.18Sensitivityof SPINT3overexpressioncells to targeted therapeutic drugs413汪海锋，等：基于文库筛选的方法确定SPINT3与胃腺癌转移之间的关联2.5mm3mm5mmaMKN-45SPINT3SgRNAb阿帕替尼明场CSB431542明场dMKN-45SPINT3sgRNA明场荧光图19靶向治疗药物对SPINT3相关的体内转移的影响Fig.19Effects of targeted therapeutic drugs on SPINT3-related metastasis in vivo*1.51.00.50MKN-45阿帕替尼SB431542SPINT3ShRNA图2 0靶向治疗药物对SPINT3相关的体内转移的统计学分析Fig.20Statistical analysis of targeted therapeutic drugsonSPINT3-relatedmetastasis invivo帕替尼与SB431542处理后小鼠肺部未出现含有绿色荧光蛋白的肿瘤细胞，说明未发生肿瘤细胞肺部转移3结论选取包含2 2 个基因的TGF1结合相关的通路，通过文库筛选与单基因验证的方式，证实SPINT3可能与胃腺癌的转移相关.SPINT3的过表达能够促进胃腺癌细胞的调亡，抑制癌细胞的增殖并限制其迁移能力.SPINT3的抑制大幅提升了胃腺癌细胞系的体内转移能力，表明SPINT3的缺失与胃腺癌的转移密切相关.为明确SPINT3可能的作用机制，根据TCGA数据库中SPINT3低表达样本中通路的富集，验证了SPINT3低表达样本中TGFB1的分泌通路显著富集.在MKN-45细胞系中，SPINT3的过表达使TGF1的表达显著增加，TGF1的下游通路SMAD3也异常激活，而胃腺癌的其他相关通路，如PI3K/AKT、ER K 1、MEK 1等均未受到SPINT3的调控.表明SPINT3的表达与TGF-B1结合通路相关.在SPINT3低表达胃癌细胞样品中，TGF-1的分泌和活化途径高度富集，常见的肿瘤相关途径，如AKT1、MEK、G S K 3、-连环蛋白在抑制SPINT3后未被激活.通过药物筛选的方式证实了阿帕替尼、SB431542能够逆转SPINT3在MKN-45SPINT3shRNA细胞系中的表达.这两种药物使MKN-45SPINT3shRNA的调亡、增殖、体内转移能力受限，表明在通过抑制SPINT3所诱导的胃腺癌转移中，可能成为靶向治疗的备选药物.参考文献1 CAO W,CHEN H D,YU Y W,et al.Changing profilesof cancer burden worldwide and in China:a secondaryanalysis of the global cancer statistics 2020J.ChineseMedical Journal,2021,134(7):783-791.2 CAO M,LI H,SUN D,et al.Cancer burden of majorcancers in China:a need for sustainable actionsJ.Can-cer Communications,2020,40(5):205-210.3 ZHOU Y,DING B Z,LIN Y P,et al.MiR-34a,as a sup-pressor,enhance the susceptibility of gastric cancer 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