2016国自然面上项目-内质网介导的细胞凋亡和炎症及破骨细胞分化信号通路在假体周围骨溶解骨组织中的作用及机制研究.pdf

申请代码H0605受理部门收件日期受理编号8167090651国家自然科学基金国家自然科学基金申请书申请书（2016版）（2016版）资助类别：面上项目亚类说明：附注说明：常规面上项目项目名称：内质网介导的细胞凋亡和炎症及破骨细胞分化信号通路在假体周围骨溶解骨组织中的作用及机制研究申 请 人：郭亭电 话：025-80860015依托单位：中国人民解放军南京军区南京总医院通讯地址：江苏省南京市中山东路305号南京军区南京总医院邮政编码：单位电话：025-80861325电子邮箱：申报日期：2016年03月05日国家自然科学基金委员会NSFC 2016基本信息申请人信息姓名 郭亭性别男出生年月1974年11月民族汉族学位 博士职称副主任医师每年工作时间（月）8电话 025-80860015电子邮箱传真国别或地区中国个人通讯地址江苏省南京市中山东路305号南京军区南京总医院工作单位中国人民解放军南京军区南京总医院主要研究领域骨科，关节外科，关节置换术后假体无菌性松动机制依托单位信息名称 中国人民解放军南京军区南京总医院联系人 郑均电子邮箱电话 025-80861325网站地址合作研究单位信息单位名称项目基本信息项目名称内质网介导的细胞凋亡和炎症及破骨细胞分化信号通路在假体周围骨溶解骨组织中的作用及机制研究英文名称Endoplasmic Reticulum-mediated apoptotic,inflammatory andosteoclastogenic signaling pathway within the osteolytic osseoustissues in aseptic loosening after total hip replacement资助类别面上项目亚类说明附注说明常规面上项目申请代码H0605.骨、关节、软组织损伤与修复C050504.生物系统的信号处理与控制基地类别研究期限2017年01月-2020年12月申请经费79.4000万元中文关键词中文关键词内质网；细胞凋亡；炎症；破骨细胞分化；骨溶解英文关键词英文关键词Endoplasmic Reticulum;Apoptosis;Inflammation;Osteoclastsogensis;OsteolyticNSFC 2016第 1 页国家自然科学基金申请书2016版版本：16010000001901313中文摘要骨溶解的发生是复杂的网络调控系统，各因素间相互作用，相互交织在错综复杂的信号通路中。大量研究人员通过调控细胞凋亡、炎症或破骨细胞分化，期望找到治疗骨溶解的有效措施。然而，由于信号通路的复杂性，单一通道的调控必然会引起其他通路的紊乱。因此，有效缓解骨溶解的方法应是恢复细胞功能和内环境稳态。内质网作为多种应激过程的共同通路，可通过UPR和ERstress与凋亡和炎症及破骨细胞分化通路相偶联，作为治疗靶点具有独特优越性。虽然对内质网与骨溶解相互关系的机制缺乏足够了解，但通过维持内质网功能或改变ERstress和UPR下游关键蛋白的表达，引起凋亡、炎症和破骨细胞分化相关基因的变化进而影响骨溶解的行为都无疑是良好的治疗思路。本项目针对这些可能，研究内质网功能维持剂和重要靶点抑制剂对骨溶解的治疗效果，分子水平上明确骨溶解骨组织中细胞凋亡和炎症及破骨细胞分化的机制，为预防和治疗骨溶解提供新的思路和方法。英文摘要The occurrence of osteolysis is the result of a multiplex activation cascade，eachfactors are interact on each other and intertwined in complex signaling pathways.Over the past years,multitudinous scientific endeavor has been focused on thereason for it,but how and why this cascade originates is not well comprehended,and this is a major area of research.Recently,researchers have focused ondesigning effective therapeutics for osteolysis by modulating the apoptotic,inflammatory and osteoclastogenic response.However,manipulating the interfacebetween these fundamental biological responses for therapeutic purposes,withoutcausing severe side effects,is a formidable challenge.Because many mediators ofcellular stress,inflammation and osteoclastogenesis are regulated simultaneously,it is unlikely that a single response that integrates apoptotic,inflammatory andosteoclastogenic signalling is responsible for the pathogenesis of osteolysis.Given this complexity,an effective approach would be to seek to re-establishfunctional homeostasis by modifying integrated biological outcomes rather thantargeting single pathways.As a common pathway of many stress processes,the ERcould be an attractive potential therapeutic target in part because ER adaptiveresponses have not had time to evolve to deal with the chronic stressesencountered due to continuous generation of wear particles in periprosthetic spaceand is interconnected with apoptotic,inflammatory and osteoclastogenic signalingpathway by UPR and ERstress.Thus,maintenance and restoration of proper ERfunction or altering the expression of the key proteins downstreamed from theERstress and UPR,which can further cause changes in apoptosis and inflammationand osteoclastogenesis,may be undoubtedly to be good therapeutic ideas.Theknowledge gained by such studies will improve the overall understanding of howosteolysis develop and indicate how they might be treated with pharmacologicalinterventions that modulate apoptosis,inflammation and osteoclastogenesi.Afascinating prospects is the pharmacological targeting,by using drugs,of thecells(primarily the osteoblasts and osteoclasts)in loosened osseous tissues andrelated reparative signalling pathways in the ER in order to repair or evenregenerate the damaged periprosthetic tissues.NSFC 2016第 2 页国家自然科学基金申请书2016版版本：16010000001901313项目组主要参与者（注:项目组主要参与者不包括项目申请人）编号姓名出生年月性别职 称学 位单位名称电话电子邮箱证件号码每年工作时间（月）1丁浩1989-01-04男医师硕士中国人民解放军南京军区南京总医院025-32128419890104803782江辉1983-02-18男主治医师硕士中国人民解放军南京军区南京总医院025-46020019830218551843李林涛1990-01-28男主治医师博士中国人民解放军南京军区南京总医院025-80860015md_413026199001280336104陈文祥1990-08-16男硕士生学士中国人民解放军南京军区南京总医院025- 340823199008166716105俞磊1986-02-01男硕士生学士中国人民解放军南京军区南京总医院025- 330122198602013535106赵志刚1977-07-24男技师学士中国人民解放军南京军区南京总医院025- 3210231977072440363总人数高级中级初级博士后博士生硕士生71222NSFC 2016第 3 页国家自然科学基金申请书2016版版本：16010000001901313国家自然科学基金项目资金预算表项目申请号/项目批准号：8167090651项目负责人：郭亭金额单位：万元序号科目名称金额1一、项目资金79.40002(一)直接费用67.000031、设备费5.00004(1)设备购置费5.005(2)设备试制费0.006(3)设备改造与租赁费0.0072、材料费40.0083、测试化验加工费3.0094、燃料动力费1.00105、差旅费1.00116、会议费1.00127、国际合作与交流费7.00138、出版/文献/信息传播/知识产权事务费2.00149、劳务费5.001510、专家咨询费1.001611、其他支出1.0017(二)间接费用12.400018其中：绩效支出3.100019二、自筹资金0.0000NSFC 2016第 4 页国家自然科学基金申请书2016版版本：16010000001901313预算说明书预算说明书（定额补助）（请按国家自然科学基金项目资金预算表编制说明中的要求，对各项支出的主要用途和测算理由及合作研究外拨资金、单价10万元的设备费等内容进行详细说明，可根据需要另加附页。）1、仪器设备费5万元 （1）购置5万元 枪式移液器，2500元/支，4支，共约1万元 电动匀浆机，15000元/台，1台，共约1.5万元 小型离心机，25000元/台，1台，共约2.5万元（2）设备试制费、改造与租赁费：无 2、实验材料费40万元 （1）原材料/试剂/药品购置费35万元 BALA/C小鼠（含饲养费），25元/只，200只，共约0.5万元；核酸合成（含测序费），1000元/OD，20OD，共约2万元；假体定制与购买，100元/枚，50枚，共约0.5万元；磨损微粒：TiNPs、CoNPs和PMMA微粒的制备、内毒素处理，1万元；ELISA检测试剂盒，2500/kit，20kits，共5万元；RT-PCR试剂盒，2000元/kit，30kits，共6万元；免疫组化和Western Blot抗体:Ki-67、Bcl-2、Bak、Bax、cleaved Caspase-3/4/8/9/12、Fas、Cyt-c、GRP78/Bip、IRE1-、PERK、ATF6、CHOP、JNK、Calpain、NF-B、c-Fos、c-Jun、NFATc1等，共10万元；TUNEL试剂盒5000元/盒，4盒共2万元；EMSA试剂盒5000/盒，2盒共1万元；Caspase-3/4/8/9/12 活性检测试剂盒，4000/盒，共2万元；MTT试剂盒、Click-iTTM EdU试剂盒、DAPI荧光染色试剂盒、Annexin V流式细胞试剂盒、JC-1 试剂盒、CA2+浓度测定试剂盒、甲苯胺蓝染液、ALP染液、HE染液、TRAP染液等，共 3.5万元；药品：4-苯基丁酸，牛磺熊去氧胆酸，Salubrinal，BAPTA-AM，4U8C，SP600125，PDTC和 PDTC，共1.5万元。（2）其他5万元 购买离心管、移液枪头、细胞培养瓶和板、培养基、血清等耗材，共约2万元；购买引物设计和病理切片染色等技术服务，共约2万元；动物饲养费及动物手术室场地及机器使用费用，共约1万元。3、测试/计算/分析费3万元 X线衍射分析（XRD），250元/样本，20个样本，共0.5万元；透射电镜，400元/样本，25个样本，共1万元；激光共聚焦显微镜成像检测，单价开机费200元+200/小时，共0.5万元；流式细胞仪检测费40/个，共250个样本，共1万元。4、能源/动力费1万元 实验室水、电以及煤气等费用，共1万元 56、会议费/差旅费2万元 参加国内学术交流参与人数8人，注册费、食宿费及往返差旅费，共约2万元 7、国际合作与交流费8万元 NSFC 2016第 5 页国家自然科学基金申请书2016版版本：16010000001901313项目组成员出国合作交流4万元 项目组成员参加国际学术交流2人次，每人次2万元，共4万元。境外专家来华合作交流3万元 邀请德国汉堡Endo-Clinic（世界最大的关节外科中心）和法兰克福类风湿关节炎中心 Dikonie-Krankenhaus医院专家来华学术交流。8、出版物/文献/信息传播费2万元 发表论文版面费1万元 查新检索费，购买参考书藉，复印资料，印刷费，入网等信息通讯费1万元 9、劳务费5万元 直接参加项目研究的研究生劳务费用，博士生每人月800元，硕士生每人月500元，5万元。10、专家咨询费1万元 11、其他支出1万元 管理费等 NSFC 2016第 6 页国家自然科学基金申请书2016版版本：16010000001901313正文正文：参照以下提纲撰写，要求内容翔实、清晰，层次分明，标题突出。请勿删除或改动下述提纲标题及括号中的文字。请勿删除或改动下述提纲标题及括号中的文字。（一）立项依据与研究内容（一）立项依据与研究内容（4000-8000 字）：1项目的立项依据项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）；人工关节置换术是治疗骨关节疾病的有效方法，能达到解除关节疼痛、重建活动功能、改善生活质量的目的。然而随着假体植入时间的延长，假体无菌性松动影响了人工关节长期稳定性和使用寿命，因各种原因需行翻修术者逐渐增多。目前全世界每年有超过 100 万台关节置换手术，翻修手术病例数已达到同期全髋关节置换手术的 20%左右，翻修的主要原因是人工关节发生无菌性松动1。而无菌性松动最常见的原因是假体磨损产生的微粒诱发假体周围组织细胞产生一系列生物学反应，并导致假体周围骨溶解2。假体周围的组织细胞（巨噬细胞，破骨细胞，成纤维细胞，成骨细胞等）吞噬理化性质稳定的磨损颗粒后，这些细胞的降解功能受挫，因体内的酶不能使其降解，而磨损颗粒引起细胞自身功能活性的改变，释放 IL-1、IL-6、TNF-、PGE2 等炎性因子以及 OPG、RANKL、M-CSF、VEGF 等趋化因子，导致成骨细胞活性降低，破骨细胞分化增加，同时诱导细胞损伤，出现细胞凋亡甚至细胞坏死现象，结果已被吞噬的磨损颗粒再次释放到细胞外基质中，诱导新的炎性细胞来吞噬，磨损颗粒被反复吞噬后导致激活的细胞分泌更多的炎性细胞因子和蛋白酶水解酶，从而诱导、维持，甚至加剧磨损微粒诱导的慢性炎性反应和凋亡反应，导致成骨细胞数量减少，破骨细胞分化增加3。而骨组织正常结构功能的维持是骨形成代谢(由成骨细胞完成)和骨吸收代谢(由破骨细胞完成)动态平衡的结果。任何引起骨代谢异常的因素如成骨细胞骨形成减少或破骨细胞骨吸收增加都会导致骨再建失衡、骨量丢失，并导致骨溶解的发生。成骨细胞吞噬磨损微粒后可引起细胞凋亡，这源于吞噬微粒引起的细胞直接毒性反应及在吞噬过程中或吞噬后，成骨细胞释放的炎性因子对其他成骨细胞的毒性反应(属间接作用)4。研究表明4，相对于巨噬细胞及其衍生细胞，成骨细胞表达更多的针对于溶骨相关细胞因子和激素的表面受体，提示成骨细胞在骨溶解当中为破骨细胞的活化提供了相应的信号通路，意味着在正常骨组织的代谢过程中，成骨细胞不仅仅扮演骨形成NSFC 2016第 7 页国家自然科学基金申请书2016版版本：16010000001901313的角色，同时也在发挥着调控骨吸收的作用。在生理性骨重建过程中，破骨细胞的激活并发挥其骨吸收作用后，随之而来的是成骨细胞有序而彻底的替代，这样的过程中不会造成明显的骨丢失。在骨溶解过程中，假体周围局部的骨破坏并没有获得充分的骨形成修复，上述所说的动态平衡关系不复存在，从而导致了持续的骨缺损，最终导致假体松动。因此，磨损微粒诱导的持续性炎症反应、成骨细胞的凋亡以及破骨细胞的分化是无菌性松动发生过程中的重要因素。目前普遍认为，单核巨噬细胞是磨损微粒靶向作用最重要的细胞及松动发生过程中的关键细胞。大量研究表明5,6，界膜组织中巨噬细胞的凋亡和炎症反应与骨溶解及无菌性松动的发生密切相关。然而，假体周围骨溶解并非仅仅由巨噬细胞引起，而是由多种细胞参与，通过细胞因子相互联系共同作用的生物反应过程。近年来，国内外更多的学者将目光投入到磨损微粒对骨组织中成骨细胞和破骨细胞影响的研究7，磨损微粒对骨组织中成骨细胞和破骨细胞的影响很有可能是松动过程中另外一个重要因素。本课题主要研究关节置换术后假体周围松动骨组织中细胞的凋亡和炎症反应以及破骨细胞分化信号通路与内质网之间的关系。一、内质网介导的细胞凋亡通路一、内质网介导的细胞凋亡通路 细胞凋亡又称细胞程序性死亡，广泛存在于多细胞生物的各种组织中，是细胞内一个积极主动的程序性生理过程。细胞受到凋亡诱导因素作用后，经信号转导系统的传递而激活凋亡基因。死亡受体活化和线粒体损伤途径是细胞内两条经典的凋亡途径，内质网应激启动的凋亡途径是近年才发现的一种新的凋亡途径。内质网(ER)是细胞内重要的细胞器，参与细胞内蛋白质的合成及合成后折叠、聚集，是调节细胞应激反应及钙水平的场所。作为细胞内最主要的 Ca2+库，内质网还参与了各种细胞信号的处理。多种生理或病理条件如蛋白质糖基化的抑制、Ca2+的流失以及氧化还原状态的改变等会引起未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网聚集，损伤内质网的正常生理功能，称为内质网应激（ER stress）8。内质网通过激活未折叠蛋白反应(UPR)以保护由 ER stress 所引起的细胞损伤，恢复细胞功能。但是如果损伤太过严重，内环境稳定不能及时恢复，ER stress可引起细胞凋亡和炎症，信号由促生存向促凋亡转换。细胞凋亡在不同环境、不同细胞及不同刺激的情况下，凋亡途径是不同的，因而细胞凋亡的信号转导途径具有多样性。尽管如此，内质网通路与死亡受体通路和线粒体通路之间存在密切相关且相互作用的关系9。NSFC 2016第 8 页国家自然科学基金申请书2016版版本：16010000001901313 图图 1 1：内质网介导的细胞凋亡和炎症信号通路内质网介导的细胞凋亡和炎症信号通路 (查阅文献基础上，自主设计图查阅文献基础上，自主设计图片片).内质网介导细胞凋亡研究较多的有两种机制：UPR 和 Ca2+起始信号。UPR是由一个内质网分子伴侣 GRP78/Bip 和 3 个内质网应激感受蛋白（PERK、ATF6和 IRE-1）所介导的。严重或长时间的 ER stress 损伤了内质网的功能时，PERK、ATF6 和 IRE-1 启动由 ER stress 所介导的凋亡信号通路，诱导细胞凋亡，然而它们并不是直接引起细胞凋亡的，而是通过激活下游凋亡信号分子 JNK，CHOP，Bcl-2 家族和 Caspase-1210(见图 1)。内质网除独立参与凋亡调节外，还在多个水平（Ca2+，Bcl-2 家族，三磷酸肌醇受体（InsP3R）或 RyR 受体，NO 等）与线粒体和死亡受体形成功能耦联，共同调控凋亡。其中 Ca2+是联系内质网与死亡受体和线粒体功能的关键环节。ER stress 存在时，Bcl-2 家族成员 Bak 和 Bax可迅速清空内质网 Ca2+，内质网和线粒体之间在某些位置上存在紧密而稳定的相互作用，这使 ER 中的 Ca2+能够在短时间内转移至线粒体，诱导线粒体通透性开放，促进 Cyt-c 释放，从而诱发细胞凋亡（线粒体途径）；此外，Ca2+浓度的升高可促使 Calcineurin 活化，介导 NFAT 家族转录因子的去磷酸化激活，启动NSFC 2016第 9 页国家自然科学基金申请书2016版版本：16010000001901313Fas受体介导的细胞凋亡(死亡受体途径)；近年研究还表明，钙激活蛋白酶Calpain与 Caspase-3 之间关系密切，两者不仅有共同的底物，而且在细胞凋亡的径路上有相互作用。然而，Caspase-3 的激活不仅可以促进死亡受体的活化和线粒体途径关键蛋白的释放，还与内质网应激紧密相连。因此，Caspase-3 是凋亡级联反应中的关键蛋白酶，是多种凋亡途径的共同下游效应部分。JNK 与 CHOP 蛋白是联系内质网应激与细胞凋亡的重要中间信号分子11,12。目前认为 JNK 主要通过两种途径促进细胞凋亡：（1）通过转录依赖的方式调节下游凋亡相关靶基因的转录和凋亡蛋白的表达而介导死亡受体途径及线粒体途径的细胞凋亡(2)通过非转录依赖的方式直接调节胞质内靶蛋白的活性而介导线粒体途径的细胞凋亡。此外，Fas 也可激活 JNK，并通过死亡受体途径或 JNK 通路诱导细胞凋亡。CHOP 是内质网应激特异的转录因子，是一个由抗凋亡向促凋亡转换的重要的信号分子，非应激状态下，它的表达水平很低，而在 ER stress 状态下，PERK、ATF6 以及 IRE-1 的活化均能诱导 CHOP 的转录，使其表达显著增加，过表达的 CHOP 聚集在细胞核内，促进细胞凋亡。此外，CHOP 和 JNK 都可以上调促凋亡基因 Bax/Bak 并抑制抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表达，减弱其抗凋亡能力，敏化内质网应激反应，促进凋亡。然而，内质网途径与线粒体途径和死亡受体途径除了可在 Caspase-3 处会合并通过 Caspase-3 激活下游底物而呈现凋亡细胞的共同特点外，另一个汇合点是 Bcl-2 及其家族成员。Bcl-2家族成员不仅存在于线粒体上，而且也定位于内质网膜上并影响 ER 的稳态12,13。Bcl-2 能够抑制 ER stress 引起的细胞凋亡，Bax和 Bak 的缺失可以保护由ER stress 引起的细胞凋亡。非应激时，位于内质网膜上的 Bax 和 Bak 与 Bcl-2结合而处于无活性状态，ER stress 时激活 CHOP 蛋白和 JNK 激酶，二者均可以削弱 Bcl-2 的抗凋亡功能，从而诱导内质网膜上 Bax和 Bak 构象变化并寡聚化最终导致内质网膜完整性的破坏和 Ca2+的外流。最近研究结果还显示:Bcl-2 可通过干扰死亡受体途径而抑制细胞凋亡。以上实验说明，内质网可以通过死亡受体途径、线粒体途径和 ER stress 途径介导细胞凋亡，他们之间存在着相互制约相互影响的作用。二、内质网介导的细胞炎症反应通路二、内质网介导的细胞炎症反应通路 最新研究发现，ER 在机体的炎症反应中也发挥重要作用，UPR 与炎症反应通路之间通过多种机制相互偶联，参与多种炎症性疾病的发生发展。其主要过程包括产生活性氧自由基（ROS）和 Ca2+，激活 NF-B 和 JNK/AP-1 通路14,15。NSFC 2016第 10 页国家自然科学基金申请书2016版版本：16010000001901313值得注意的是，这些信号通路在磨损微粒诱导炎症反应和骨溶解中也发挥着重要作用16。体外和体内研究证实，磨损微粒主要通过 NF-B 和 JNK/AP-1 途径促进炎症因子（TNF-,IL-1 和 IL-6）的产生和骨溶解的进展。与此同时，研究者们还发现，针对 NF-B 和 AP-1 途径的靶向治疗药物能够有效缓解微粒诱导的炎症性骨溶解的症状；在 JNK 缺失的小鼠中，TNF-，IL-1 和 IL-6 等炎症因子的表达显著降低17。目前研究发现，UPR 的 3 条信号通路（IRE1-,PERK 以及ATF6）均能激活 NF-B。在 IRE1 基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞中17，内质网应激诱导的 NF-B 和 JNK/AP-1 的激活以及 TNF-的产生明显减少；ER stress诱导剂或紫外线照射处理细胞后，PERK 通路被激活，NF-B 入核增加；同样ATF6 也能激活 NF-B 信号通路。另外，大量未折叠蛋白聚集引起的 ER stress导致的氧化应激反应和Ca2+释放可能也是ER stress激活NF-B的机制之一14,15。图图 2 2：内质网介导的细胞炎症信号通路：内质网介导的细胞炎症信号通路 (查阅文献基础上，自主设计的图片查阅文献基础上，自主设计的图片).ER stress 和 UPR 可导致氧化应激反应和 Ca2+失衡，而线粒体 ROS 和 Ca2+又能进一步影响 ER 内多肽折叠以及分子伴侣的功能，加重 ER stress 和 UPR。NSFC 2016第 11 页国家自然科学基金申请书2016版版本：16010000001901313通过这种正循环，内质网 Ca2+的释放、ROS 的产生和 UPR 反应一起，激活 Ca2+依赖蛋白及 JNK-AP-1 和NF-B 信号通路，进而加重炎症反应14,15,18。以往研究发现，不同类型的磨损微粒都能够诱导 ROS 的释放。最新研究还发现，在假体-骨界面产生的 ROS 能够通过 NF-B 和 AP-1 通路促进炎症因子的释放，加重骨溶解。然而 ER stress 与炎症的作用并不是单方面的，炎症因子也可激活 ER stress，研究表明14,15，TNF-能导致 UPR 激活，表现为 XBP1、GRP78/Bip 以及磷酸化 eIF2 表达增加；此外,TNF-，IL-1 和 IL-6 也可激活 NF-B 信号通路14,15，分泌更多的炎症因子，从而促进炎症反应的恶性循环。其机制可能与炎症因子促进 ER 内 Ca2+释放和 ROS 聚集，从而干扰蛋白质正确折叠以及线粒体代谢平衡有关。三、内质网介导的破骨细胞分化通路三、内质网介导的破骨细胞分化通路 图图 3：破骨细胞分化信号通路破骨细胞分化信号通路(图片来源于图片来源于 Advances in osteoclast biology.Nature Reviews Rheumatology.2011;7:235-243).破骨细胞(OC)是骨组织中特有的一种多核细胞，是唯一具有骨吸收活性的细胞类型。在破骨细胞分化过程中，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)与细胞核因NSFC 2016第 12 页国家自然科学基金申请书2016版版本：16010000001901313子 B 受体活化因子配基(RANKL)结合于细胞表面受体上，提供破骨细胞存活、增殖的信号并激活相应的信号转导通路，使分化中的破骨细胞表达特异性基因，使成熟的破骨细胞执行骨吸收功能。而 OPG 可阻断 RANKL 与 RANK 结合以抑制破骨细胞的分化、抑制成熟破骨细胞的骨吸收活性并诱导其凋亡。此外，通过对骨硬化病的研究，人们发现，介导 OC 分化成熟的各种细胞因子(M-CSF、RANKL,TNF-,IL-1)都会通过复杂的信号传导通路直接或间接地来调控关键核基因的表达,从而促进或抑制 OC 分化成熟。其中涉及到的终端转录因子有NF-B、AP-1(主要是 c-Fos 和 c-Jun)、NFAT 等19-21，并由此启始 TRAP、降钙素受体、组蛋白酶 K、碳酸苷酶等基因的转录，从而促进破骨细胞的分化。各通路并非单独起作用，而是错综复杂的交织在一起，彼此相互影响，形成同一个完整的调节网络。TRAF6 是 RANKL 信号转导通路中必需的上游效应器，通过 IKK 活化 NF-B，使其与 IB 分离并迅速转位进入细胞核，与一系列基因如IL-1、IL-6、TNF-、M-CSF 的启动子区域的 B 结合位点结合，启动这些基因的转录。NFAT 是新近发现的破骨细胞内又一条信号转导通路，是一种 Ca2+调节性转录因子，包括 5 名成员(NFATc 1-4 和 NFAT5)。研究发现19-21，RANKL 能够激活 TRAF6/NF-B 和 JNK/AP-1 途径以及 Ca2+/Calcineurin 通路，活化NFATc1，从而诱导破骨细胞的分化;特异性阻断 Calcineurin 可抑制破骨细胞的分化；在 Fos-/-的破骨祖细胞中，NFATc1 表达水平降低；在 RANKL 存在的条件下，沉默 NFATc1 基因能够有效的抑制磨损微粒诱导的破骨细胞分化22，说明 NFATc1 在磨损微粒诱导破骨细胞的激活中是必不可少的。然而破骨细胞分化与与炎症的作用并不是单方面的，炎症因子也可激活破骨细胞分化23,24。研究表明，TNF-通过正向调节成骨细胞表达 RANKL、M-CSF和 IL-6 并增强破骨细胞前体细胞对 RANKL 的反应性促进破骨细胞分化；IL-1以旁分泌的方式诱导 M-CSF 和 IL-6 的产生，还可通过激活 JNK 而促进 OC 前体细胞分化为成熟破骨细胞。Ca2+信号在破骨细胞分化、激活及凋亡中具有重要作用，Calcineurin 参与调节破骨细胞活性；应用药物改变细胞内 Ca2+水平可影响RANKL 诱导的破骨细胞分化和凋亡。NF-B 和 c-Fos 基因缺陷的小鼠由于破骨细胞分化缺陷而都患有骨硬化病；JNK-/-基因敲除小鼠髓腔内单核细胞分化为破骨细胞数量明显减少。此外，NF-B 和 JNK/AP-1 信号通路特异性抑制剂能够有效的缓解磨损微粒诱导的破骨细胞分化和炎症反应。以上实验说明，Ca2+、NF-BNSFC 2016第 13 页国家自然科学基金申请书2016版版本：16010000001901313和 JNK 信号通路在磨损微粒诱导的炎症反应和破骨细胞分化过程中发挥重要作用。综上所述，内质网在不同环境及不同刺激的情况下，发生的作用是不同的，因而内质网的信号转导途径具有多样性。虽然刺激信号可激活三条通路中的一种，但是在某些情况下三者是相互联系的，它们之间通过内质网存在一定的交联。因此，我们可以通过对内质网功能的调节，来改变骨组织中的细胞凋亡和炎症以及破骨细胞分化过程，从而为骨溶解的治疗提供新的靶点。四、内质网的治疗潜力和未来发展方向四、内质网的治疗潜力和未来发展方向 信号通路是一个复杂的网络调控系统，各因素间相互作用，相互交织在错综复杂的信号通路中。内质网作为多种应激过程可能的共同通路，通过 UPR 和ER stress 与细胞内凋亡和炎症以及破骨细胞分化通路相偶联8,9,14,15。近年来，ER stress 在疾病发生发展过程中的作用已成为研究的热点。关于内质网的研究增强了我们对内质网生物学功能的了解，科研人员已经发现内质网与骨溶解的发生有着千丝万缕的联系。在假体周围磨损微粒的长期刺激下，细胞损伤太过严重，蓄积在内质网内的压力过大，内质网适应性反应还没来得及做出调整，就引起细胞的凋亡和炎症反应以及破骨细胞的分化，导致骨溶解的加重。通过对内质网功能的调节，可改变下游基因的表达，改变细胞或组织的蛋白合成，进而改变其生物学功能。因此，内质网可作为一种新的治疗靶点，为骨溶解的临床诊断和治疗提供一种新的思路。同时，由于内质网所作用的下游目的基因的不同，其发挥的作用也不尽相同，内质网与骨溶解之间复杂的调控和作用关系决定了对该领域的的深入研究具有广阔的发展前景。最新研究发现25，内质网功能维持剂 4-苯基丁酸（4-PBA）和牛磺熊去氧胆酸（TUA）能够通过降低PERK 和 IRE1 的磷酸化来减轻 ER stress 反应。我们的前期研究也表明26，磨损微粒通过 ER stress 反应促进炎症因子的表达，进而引起了骨溶解的发生；应用 4-PBA 后，破骨细胞的分化减少，炎症因子的表达降低，骨溶解症状得到明显改善。此外，内质网功能和应激反应的替代疗法也包括 UPR 的调节。Salubrinal是一个小分子，可通过选择性抑制 eIF2 蛋白的去磷酸化，促进蛋白质的合成以及抑制内质网应中的未折叠蛋白的积累，从而在体内和体外保护细胞免受 ER stress 诱导的细胞损伤27。骨溶解的发生是多因素共同作用的结果，内质网可调控多种靶基因及相应信号通路，作为治疗靶点比起传统治疗化疗方法具有独特的优越性。虽然对内NSFC 2016第 14 页国家自然科学基金申请书2016版版本：16010000001901313质网与骨溶解相互关系机制的研究缺乏完全足够的了解，但是通过改变成骨细胞中ER stress和UPR表达水平的变化或者通过改变 ER stress下游关键蛋白的表达，引起凋亡和炎症相关基因的变化进而直接影响骨溶解的生物学行为都无疑是良好的临床治疗思路。最新研究表明5,6,26，假体周围的巨噬细胞吞噬磨损颗粒后可以通过 ER stress、线粒体损伤和死亡受体活化途径促进细胞凋亡，并通过 NF-B 和 JNK/AP-1 途径促进局部炎症反应和破骨细胞的分化；同时微粒诱导的炎性因子又可以激活 NF-B 和 JNK/AP-1 信号通路，分泌更多的炎症因子，招募更多的破骨细胞和破骨细胞前体细胞，进一步加重局部骨代谢不平衡和骨溶解症状；此外，NF-B 和 JNK/AP-1 通路的抑制剂可减少炎症因子的产生并抑制骨溶解的发生16；由于成骨细胞和破骨细胞也存在于假体周围并且也受到磨损颗粒的影响，因此我们猜测，磨损微粒对骨组织中的成骨细胞和破骨细胞的影响很有可能是无菌性松动过程中另外一个重要因素，但是对于成骨细胞识别磨损微粒后参与到假体松动过程中的机制，目前还不清楚。研究发现28，成骨细胞吞噬磨损微粒后可引起成骨细胞凋亡并激活NF-B和和JNK/AP-1通路,引起成骨细胞释放炎性因子、化学趋化因子等，通过自分泌或旁分泌的方式来影响成骨细胞的功能和促进破骨细胞的分化。但是发生骨溶解的骨组织中是否存在成骨细胞的凋亡和炎症与破骨细胞的分化以及这些信号通过何种途径进行传导目前尚不清楚，尤其是干预信号通路中的重要靶点蛋白或维持内质网功能对成骨细胞和破骨细胞的影响以及对骨溶解的治疗效果更是鲜有报道。根据以上结果我们猜测磨损微粒可能通过内质网介导的 ER stress、线粒体损伤和死亡受体活化途径促进骨组织中成骨细胞凋亡，并通过 ROS 和 Ca2+途径，AP-1 和NF-B 通路促进炎症因子的产生和破骨细胞的分化，从而加重骨溶解的症状。本项目针对这些可能，设计实验，阐明磨损微粒通过细胞凋亡和炎症反应以及破骨细胞分化过程促进骨溶解发生的机理，寻找有效的治疗靶点，以期为无菌性松动的预防和早期治疗提供新的治疗靶点。继续深入研究内质网及其基因调控和信