2、2018国自然申请书正式版.pdf

申请代码H0518受理部门收件日期受理编号8177030735国家自然科学基金国家自然科学基金申请书申请书（2017版）（2017版）资助类别：面上项目亚类说明：附注说明：常规面上项目项目名称：MicroRNA-30b通过调节自噬参与慢性肾脏病血管钙化的机制研究申 请 人：姚丽电 话：024-83282100依托单位：中国医科大学通讯地址：辽宁省沈阳市和平区南京北街155号邮政编码：110001单位电话：024-31939077电子邮箱：liyao_申报日期：2017年02月25日国家自然科学基金委员会NSFC 2017基本信息申请人信息姓名 姚丽性别女出生年月1970年01月民族汉族学位 博士职称教授每年工作时间（月）6电话 024-83282100电子邮箱liyao_传真国别或地区中国个人通讯地址辽宁省沈阳市和平区南京北街155号工作单位中国医科大学/附属第一医院肾内科主要研究领域慢性肾脏病及其并发症的发病机制与防治依托单位信息名称 中国医科大学联系人 于东电子邮箱电话 024-31939077网站地址合作研究单位信息单位名称项目基本信息项目名称MicroRNA-30b通过调节自噬参与慢性肾脏病血管钙化的机制研究英文名称Studies of mechanisms of vascular calcification in the chronic kidneydisease regulated by microRNA-30b through autophagy资助类别面上项目亚类说明附注说明常规面上项目申请代码H0518.泌尿系统疾病其他科学问题基地类别研究期限2018年01月01日-2021年12月31日研究方向：上述代码和研究方向不能涵盖的泌尿系统非肿瘤疾病的其它科学问题申请直接费用 60.0000万元中文关键词中文关键词血管钙化；慢性肾脏病；MicroRNA-30b；自噬英文关键词英文关键词vascular calcification;chronic kidney disease;MicroRNA-30b;autophagyNSFC 2017第 1 页国家自然科学基金申请书2017版版本：17010000003013679中文摘要血管钙化是慢性肾脏病（CKD）患者常见并发症之一，是心血管事件的重要原因。研究表明，细胞自噬在血管钙化中发挥重要作用，然而miRNA在自噬和血管钙化过程中的作用及其调节机制尚不清楚。本课题组前期工作显示，CKD高磷状态下miR-30b可以靶向Wnt5A和Beclin1，进而影响大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）自噬和钙化；并发现Wnt/-catenin-pit1通路介导高磷诱导的VSMCs钙化过程。在此基础上，本项目拟采用病人样本和人VSMCs，利用分子和细胞生物学手段，验证miR-30b-Wnt5A-Wnt/-catenin和miR-30b-Beclin1信号通路对VSMCs自噬和血管钙化的影响；并构建CKD大鼠模型，验证干预上述信号通路对逆转血管钙化的可行性。本课题为防治慢性肾脏病血管钙化提供新的靶点和策略。英文摘要Vascular calcification is a common complication in patients with chronic kidneydisease(CKD),and is a critical factor for cardiovascular events.It has beenshown that autophagy plays an important role in vascular calcification,but therole of miRNA in autophagy and vascular calcification is not clear.In ourprevious work,we found that miR-30b targeted Wnt5A and Beclin 1 to affectvascular smooth muscle cell(VSMC)autophagy and vascular calcification.Moreover,we found that Wnt/-catenin-pit1 signaling pathway was involved inhigh-phosphorus induced calcification.Based on these results,our project aimsto apply clinical samples and human VSMCs to explore the role ofmiR-30b-Wnt5A-Wnt/-catenin and miR-30b-Beclin 1 signaling pathways in autophagyand vascular calcification by applying the molecular and cellular biology methods.Besides,we aim to establish a rat model of CKD to identify the possibility of intervention the aforementioned signaling pathways to reverse the vascularcalcification.This project will provide novel targets and strategies fortreatment of vascular calcification in CKD patients.NSFC 2017第 2 页国家自然科学基金申请书2017版版本：17010000003013679项目组主要参与者（注:项目组主要参与者不包括项目申请人）编号姓名出生年月性别职 称学 位单位名称电话电子邮箱证件号码每年工作时间（月）1刘林林1979-12-18女副教授博士中国医科大学024-83282507catherine-21120219791218002062徐天华1985-06-25女讲师硕士中国医科大学024- 21010519850625532X63杜银科1982-10-08男讲师硕士中国医科大学024- 61032419821008233X64万鹏志1994-01-07男硕士生学士中国医科大学024-83282507wpz_ 211103199401070313105盛子桐1994-04-01男博士生学士中国医科大学024-210106199404014016106田滨瑶1993-01-20女硕士生学士中国医科大学024- 210103199301203624107邱小波1986-10-15女硕士生学士中国医科大学024-42280219861015102910总人数高级中级初级博士后博士生硕士生82213NSFC 2017第 3 页国家自然科学基金申请书2017版版本：17010000003013679国家自然科学基金项目资金预算表项目申请号：8177030735项目负责人：姚丽金额单位：万元序号科目名称金额备注(1)(2)(3)(1)(2)(3)1一、直接费用60.000021、设备费0.00003(1)设备购置费0.004(2)设备试制费0.005(3)设备改造与租赁费0.0062、材料费36.00抗体，试剂，载体，工具酶，培养瓶/皿等73、测试化验加工费10.00 芯片分析、测序等84、燃料动力费0.0095、差旅/会议/国际合作与交流费5.00直接用于与本项目有关的国内调研和学术会议106、出版/文献/信息传播/知识产权事务费3.00 发表论文版面费等117、劳务费5.00直接参加研究的研究生的劳务费128、专家咨询费1.00咨询项目组外专家科研核心技术和方法的费用139、其他支出0.000014二、自筹资金来源0.0000NSFC 2017第 4 页国家自然科学基金申请书2017版版本：17010000003013679预算说明书预算说明书（定额补助）（请按国家自然科学基金项目资金预算表编制说明中的要求，对各项支出的主要用途和测算理由及合作研究外拨资金、单价10万元的设备费等内容进行详细说明，可根据需要另加附页。）1.设备费：0 万元 2.材料费：36 万元 大鼠及饲养：4万元；细胞培养板、培养瓶：5万元；RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量 PCR 试剂盒：4万元；蛋白提取试剂盒、蛋白定量试剂盒、ECL 蛋白检测试剂盒：4万元；功能解析用一抗：4000 元10 支=4万元；免疫荧光检测试剂盒：2万元；质粒转染试剂：1万；CRISPR 载体构建及慢病毒包装：4万元；细胞培养基、血清、自噬激动剂及自噬抑制剂，3万元；免疫共沉淀试及染色质免疫共沉淀试剂盒：5万元；3.测试化验加工费：10万元 质粒测序、合成引物等：3万元；过表达质粒构建和效果检测：2万元；投射电镜检测、激光共聚焦检测、流式细胞仪等：5万元；4.燃料动力费：0万元 5.差旅费/国际合作与交流费/会议费：5万元 市内交通费：0.6万元；外地往返差旅费：1000 元/人次12人次=1.2万元；项目组成员参加学术交流会，预计 8 次：2000元/人次2人8次=3.2万元；8.出版/文献/信息传播/知识产权事务费：3万元 文献检索：0.4万元；论文发表版面费：国内核心期刊 0.6万元；国外 SCI 期刊 2万元；9.劳务费：5万元 用于发放直接参加项目的研究生的劳务费。10.专家咨询费：1万元 项目组外专家咨询科研核心技术和方法、思路等费用。NSFC 2017第 5 页国家自然科学基金申请书2017版版本：17010000003013679报告正文 报告正文（一）立项依据与研究内容（一）立项依据与研究内容（4000-8000 字）：1项目的立项依据项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）；血管钙化是慢性肾脏病患者心血管事件的重要原因 血管钙化是慢性肾脏病患者心血管事件的重要原因 慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）是一类危害全球人类健康的重大疾病。矿物质骨代谢异常导致的血管钙化（vascular calcification）是其特有而常见的合并症矿物质骨代谢异常导致的血管钙化（vascular calcification）是其特有而常见的合并症，是CKD患者心血管事件的重要原因，导致患者全因和心血管死亡率显著增加1。血管钙化是肌肉性的动脉壁由于中膜和/或内膜钙化所导致的增厚和弹性丧失的病理过程，包括中膜钙化、动脉粥样硬化内膜钙化和瓣膜钙化三种类型2。临床研究发现，CKD3-5期患者47%-83%存在血管钙化，且较普通人群更加普遍和严重，进展更快。血管钙化也是缺血性心脏病、左心室肥厚、心衰以及全因死亡的独立危险因素3。因此，深入解析CKD血管钙化的病理发生过程，对于精准诊断和防治CKD患者多种心血管疾病，改善预后具有重大研究意义和临床价值。血管钙化的发生机制尚未阐明 血管钙化的发生机制尚未阐明 以往观点认为，血管钙化是矿物质在血液中过度饱和从而沉积于血管壁的被动后果，而非主动调节的过程。近来研究表明，血管钙化是一个与骨发育相似的主动的、可预防和逆转的高度可调控的生物学过程4。在这一过程中，收缩性血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）向成骨/软骨表型转化并合成和分泌多种骨形成蛋白，如骨形态发生蛋白、骨桥蛋白、骨连接素和骨钙蛋白等，在细胞外基质或胞质中形成钙结节。最近流行病学和临床研究表明，高磷血症是 CKD 患者血管钙化的始动因素；控制血磷能够显著减缓终末期肾脏病患者血管钙化的进程5,6。基础研究发现，高浓度磷能够诱导 VSMCs 钙化，并向成骨细胞的表型转化，且磷诱导的钙化程度与磷处理的剂量和时间正相关7。但临床防治高磷血症的手段有限，通过饮食、药物或透析严格控制血磷水平存在诸多困难，很难实现。但临床防治高磷血症的手段有限，通过饮食、药物或透析严格控制血磷水平存在诸多困难，很难实现。高磷诱导 CKD 血管钙化的分子机制错综复杂，NSFC 2017第 6 页国家自然科学基金申请书2017版版本：17010000003013679目前尚未完全阐明，仍须从寻找新的干预靶点和治疗策略的角度，深入探索血管钙化的发生机制。自噬在血管钙化中的作用及其调控机制 自噬在血管钙化中的作用及其调控机制 细胞自噬是真核生物细胞内普遍存在的一种自稳机制,通过将细胞质中受损或失去功能的蛋白质以及细胞器经双层膜结构包裹运输到溶酶体进行消化降解，在维持细胞存活、分化、发育以及稳态中发挥至关重要的作用。在正常生理状态下，细胞自噬维持在一个很低的水平以调控细胞稳态如蛋白质或细胞器更新。当外界环境变化时，自噬可以帮助细胞在缺乏营养或应激等条件下生存8。最近研究表明，细胞自噬通过减少释放基质小泡而减轻磷酸盐引起的血管钙化。此外，自噬诱导剂丙戊酸可以有效改善体外大鼠主动脉及牛主动脉 VSMCs 钙化9。因此，调节细胞自噬水平可能为防治血管钙化提供新的干预手段调节细胞自噬水平可能为防治血管钙化提供新的干预手段。自噬的调控机制非常复杂，参与的信号通路众多。其中，miRNAs 通过调控自噬相关基因的表达发挥对自噬的调节作用10。miRNA 是一大类进化保守、内源性的非编码 RNAs，通过结合到 mRNA 的 3UTR 序列而降低蛋白表达水平，从而在生理或病理过程中发挥重要作用11,12。已有研究证实，部分 miRNAs 对自噬有抑制作用，另有部分 miRNAs 能激活自噬13。研究发现越来越多的 miRNA 参与到血管钙化和心血管疾病这一病理过程中。例如，抑制 miR-125b 可导致 Runx2 和 osterix 表达升高，从而促进碱性磷酸酶活性增强以及 VSMCs 钙化14；人主动脉 VSMCs 暴露于高磷条件下，miR-205 的表达会持续下降，导致其靶基因 Smad1 和 Runx2 高表达，进而诱导 VSMCs 钙化15。另有研究报导多个 miRNAs 参与血管钙化的调控作用，包括 miR-204、miR-133、miR-30b 和 miR-30c16,17等。然而，miRNA 通过调节自噬参与 CKD 血管钙化病理过程的作用及其机制尚未有报道。miRNA 通过调节自噬参与 CKD 血管钙化病理过程的作用及其机制尚未有报道。针对这一科学问题，我们前期开展了如下研究：首先检测高磷处理后的 VSMCs中多个自噬相关的 miRNA 表达水平。结果显示，miR-30b 在高磷处理的 VSMCs 中下调最为明显，因此我们进一步探究 miR-30b 的靶基因。Beclin1 作为一种 BH3-only 蛋白，是调节细胞自噬的重要分子。Beclin1 与型磷脂酰肌醇 3 激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI3KC3）形成 Beclin1-PI3KC3 复合体，通过招募自噬蛋白参与自噬体成熟，促进自噬发生。我们发现，miR-30b 能够靶miR-30b 能够靶NSFC 2017第 7 页国家自然科学基金申请书2017版版本：17010000003013679向调节 Beclin1，从而参与调控细胞自噬水平。进一步，我们在高磷诱导的大鼠VSMCs 中过表达 Beclin1，发现自噬水平显著增强，而细胞钙化程度显著减弱向调节 Beclin1，从而参与调控细胞自噬水平。进一步，我们在高磷诱导的大鼠VSMCs 中过表达 Beclin1，发现自噬水平显著增强，而细胞钙化程度显著减弱1818。这些结果表明，高磷通过 miR-30b-Beclin1 轴发挥对自噬的调控作用，减轻细胞钙化。高磷通过 miR-30b-Beclin1 轴发挥对自噬的调控作用，减轻细胞钙化。MiR-30b 通过多靶点调控自噬从而参与 CKD 血管钙化的调控 MiR-30b 通过多靶点调控自噬从而参与 CKD 血管钙化的调控 众所周知，miRNA 可能存在多个靶基因，通过对这些靶基因的调控多方面地参与生物学过程。我们前期工作还发现，Wnt/-catenin-pit1 通路介导了高磷诱导的 VSMCs 钙化19。此外，多篇报道表明-catenin 能够有效抑制细胞自噬。多篇报道表明-catenin 能够有效抑制细胞自噬。例如，在急性白血病 THP-1 细胞中，-catenin 高表达能够稳定细胞复制和抑制自噬，从而导致细胞低度分化；当 LecB 诱导-catenin 降解后，细胞的自噬活性增强，分化能力升高20。在前列腺癌细胞中，信号分子一氧化氮（nitric oxide,NO）能够诱导-catenin 聚集于细胞核，进而抑制自噬21。在结肠癌细胞中，Wnt/-catenin 信号通路显著抑制基础水平以及压力诱导的自噬22。为检测 miR-30b 能否干扰 Wnt/-catenin 通路，从而影响-catenin 依赖的自噬过程，我们将 miR-30b inhibitor 转染到高磷处理后的 VSMCs 中。结果表明，抑制 miR-30b 可以降低-catenin 和 pit1 表达。进一步查阅文献发现：Wnt5A,作为能够负向调节 Wnt/-catenin 信号通路的分子23，是 mir-30b 的一个作用靶点24。我们前期实验显示，miR-30b inhibitor 能够显著上调 VSMCs中的 Wnt5A；过表达 Wnt5A 能够显著抑制-catenin 和 pit1 的表达水平（见工作基础），说明 miR-30b 很可能通过靶向 Wnt5A 影响了 Wnt/-catenin 信号通路的活性。科学假说 科学假说 综上所述，高磷环境下的 VSMCs，细胞内 Wnt/-catenin 信号通路和miR-30b 介导的下游事件存在交互对话。这个发现提示细胞内源性 miR-30b 下调对血管钙化的影响是通过双重路径实现的。至此，我们提出如下科学假说（图 1）：1.高磷通过调控 Wnt/-catenin 信号通路对细胞自噬产生作用，从而影响细胞1.高磷通过调控 Wnt/-catenin 信号通路对细胞自噬产生作用，从而影响细胞钙化过程；同时，Wnt/-catenin 通路通过 pit1 调控细胞钙化（虚线部分）。钙化过程；同时，Wnt/-catenin 通路通过 pit1 调控细胞钙化（虚线部分）。2.高磷下调 miR-30b 表达，进一步通过 Beclin1 和 Wnt5A 直接和间接地参与对2.高磷下调 miR-30b 表达，进一步通过 Beclin1 和 Wnt5A 直接和间接地参与对自噬的调控，产生抑制钙化的效应。自噬的调控，产生抑制钙化的效应。NSFC 2017第 8 页国家自然科学基金申请书2017版版本：17010000003013679 图 1 高磷过调节自噬参与血管钙化的分子机制示意图 图 1 高磷过调节自噬参与血管钙化的分子机制示意图 本项目拟采用临床患者动脉样本和人主动脉 VSMCs，利用分子和细胞生物学手段，验证 miR-30b-Wnt5A-Wnt/-catenin 和 miR-30b-Beclin 1 对细胞自噬和钙化的影响。进一步，利用大鼠慢性肾脏病模型的体内研究平台，结合药理手段，验证干预 miR-30b-Wnt5A-Wnt/-catenin 和 miR-30b-Beclin 1 信号通路对逆转高磷诱导血管钙化的可行性。本课题的研究价值和意义在于：本课题的研究价值和意义在于：1）创新性强，高磷诱导的自噬对于血管钙化的内在拮抗作用是近年来发现的现象，然而其分子机制未知。本研究首次发现miR-30b 通过 Beclin1 和 Wnt5A 靶基因调节自噬，从而遏制细胞钙化，推动了该领域的发展；2）国内外对于 miRNAs 的研究多集中于单靶点的解析，忽略了miRNAs 多靶点的协作效应。本研究以血管钙化这个病理过程为突破口，首次解析了 miR-30b 通过下游双重信号的共同协作促进细胞自噬并拮抗血管钙化；3）本研究鉴定出了有价值的干预靶点，并利用体外和体内模型研究多靶点共同干预策略的可行性，为防治 CKD 血管钙化提供新的思路和依据。参考文献参考文献 1.Grriz JL,Molina P,Cervern MJ,Vila R,Bover J,Nieto J,Barril G,Martnez-Castelao A,Fernndez E,Escudero V,Piera C,Adragao T,Navarro-Gonzalez 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MK,Kim JC,Sung YK.Wnt5a attenuates Wnt/beta-catenin signalling in human dermal papilla cells.Exp Dermatol,2013,22(3):229-31.24.Mosakhani N,Guled M,Lahti L,Borze I,Forsman M,Pkknen V,Ryhnen J,Knuutila S.Unique microRNA profile in Dupuytrens contracture supports deregulation of beta-catenin pathway.Mod Pathol,2010,23(11):1544-52.2 项目的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键科学问题项目的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键科学问题（此部分为重点阐述内容）；2.1 研究目标 2.1 研究目标 1.证实 miR-30b-Wnt5A-Wnt/-catenin 信号通路，并探究其在细胞自噬和血管钙化中的作用。2.研究 miR-30b-Beclin 1 信号通路在细胞自噬和血管钙化中的作用。3探究干预 miR-30b 及其下游信号对逆转血管钙化的可行性。2.2 研究内容（I）征集临床慢性肾脏病维持性血液透析伴高磷血症的患者，取失功动静脉内2.2 研究内容（I）征集临床慢性肾脏病维持性血液透析伴高磷血症的患者，取失功动静脉内瘘动脉段作为试验组标本，同龄人群（取材于肾脏肿瘤根治术患者）肾动脉为瘘动脉段作为试验组标本，同龄人群（取材于肾脏肿瘤根治术患者）肾动脉为对照组，鉴定 miR-30b，Wnt5A，Beclin1 在 VSMCs 中的表达以及与血管钙化指对照组，鉴定 miR-30b，Wnt5A，Beclin1 在 VSMCs 中的表达以及与血管钙化指标之间的关联。标之间的关联。NSFC 2017第 12 页国家自然科学基金申请书2017版版本：17010000003013679征集 30 例临床 CKD 维持性血液透析伴高磷血症的患者，在动静脉内瘘重建过程中，取失功动静脉内瘘动脉段为实验组样本，取肾脏肿瘤根治术患者肾动脉作为对照组（取肾肿瘤切除术废弃的标本中外观肿瘤边缘距离肾门大于等于 5cm 的肾动脉，且光镜下证实无瘤细胞）：原位杂交技术检测血管 VSMCs 中的 miR-30b 的含量；免疫组化检测 Wnt5A 和 Beclin1 的表达水平；采用 Von Kossa 染色、alizarin red S 染色以及钙沉积测定检测血管钙化情况，鉴定 miR-30b，Wnt5A 和 Beclin1 在 VSMCs 中的表达和血管钙化指标之间的关联。(II)利用 loss of function 和 gain of function 手段，验证干扰/过表达(II)利用 loss of function 和 gain of function 手段，验证干扰/过表达miR-30b 对下游靶基因的影响，以及它们介导的细胞自噬和钙化的改变。miR-30b 对下游靶基因的影响，以及它们介导的细胞自噬和钙化的改变。培养人原代主动脉 VSMCs，利用 Anti-Ago2-ribonucleoprotein IP(RIP)技术，联合 RT-PCR 证明 Wnt5A 和 Beclin 1 的 mRNA 能够被 DISC 复合物所富集；利用 3UTR luciferase reporter assay 验证 Wnt5A 和 Beclin 1 为miR-30b 的直接靶基因；研究利用 miR-30b 过表达或抑制对 VSMCs 自噬和钙化的影响。(III)在人 VSMCs 敲除或过表达 Wnt5A 和 Beclin 1，检测高磷诱导的细胞自噬(III)在人 VSMCs 敲除或过表达 Wnt5A 和 Beclin 1，检测高磷诱导的细胞自噬和钙化，阐释 miR-30b 下游靶基因对血管钙化的生物学意义。和钙化，阐释 miR-30b 下游靶基因对血管钙化的生物学意义。分别抑制或过表达 Wnt5A 和 Beclin 1，观察高磷培养液处理的 VSMCs 自噬和细胞钙化的变化。(IV)通过操纵上游信号miR-30b-Wnt5A-Wnt/-catenin和 miR-30b-Beclin1，(IV)通过操纵上游信号miR-30b-Wnt5A-Wnt/-catenin和 miR-30b-Beclin1，验证细胞自噬和钙化的变化；进一步，通过直接操纵下游自噬检验其对细胞钙验证细胞自噬和钙化的变化；进一步，通过直接操纵下游自噬检验其对细胞钙化的影响。化的影响。AA 操纵上游信号：操纵上游信号：条件分别为：条件分别为：1.Wnt5A 基因敲除+Beclin 1 基因敲除的 VSMCs+miR-30b inhibitor 2.Wnt5A 基因过表达+Beclin 1 基因过表达的 VSMCs+miR-30b mimic NSFC 2017第 13 页国家自然科学基金申请书2017版版本：17010000003013679在高磷诱导下的上述基因操作和转染后的 VSMCs 中，与对照细胞相比较，检测细胞自噬和钙化的变化。BB 操纵下游信号：操纵下游信号：条件分别为：条件分别为：1.自噬抑制剂(3-methyladenine)2.自噬诱导剂（valproic acid）在高磷诱导下的上述药物处理的 VSMCs 中，检测下游信号、细胞自噬和钙化的变化。(V)在 VSMCs 以及动物模型中，针对以上探索出的新分子靶点进行联合干预，(V)在 VSMCs 以及动物模型中，针对以上