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NSFC案例精讲班(四)解螺旋课堂2017酸菜解 螺 旋 课 堂0课 程 内 容文献案例分析科学假设模式132标书写作讲解解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析图1.建立肿瘤细胞-内皮细胞共培养体系，选择5株肿瘤细胞株，检测其影响的内皮细胞miRNA表达谱，对于趋势一致的miRNA分子，进行qPCR验证解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析图2.查找miRNA改变的来源，排除了细胞因子驱动，前体pre-miRNA改变，确认来源于肿瘤细胞分泌的微泡（microvesicles，MVs）解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析图3.肿瘤细胞分泌的微泡携带的miR-9能够促进内皮细胞迁移（过表达+抑制实验）解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析图4.在动物实验中，沉默miR-9能够抑制肿瘤血管生成，效果与anti-VEGF类似解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析图5.抗体芯片筛选通路发现miR-9能够影响内皮细胞JAK-STAT通路中STAT1,3、JAK1,2的磷酸化，数据库预测靶基因定位于SOCS5，并用荧光素酶报告实验证实SOCS5已知是JAK-STAT通路的负调节因子解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析图6.miR-9对STAT的活化依赖于JAK1,2（siRNA+抑制剂），表型：内皮细胞迁移，动物肿瘤大小解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析癌症JAK-STAT内皮细胞迁移血管生成miR-9科学假设：逻辑思路：A分子筛选miR-9 Fig.1BFig.2分子筛选miR-9 细胞微泡CFig.3,4miR-9细胞微泡内皮细胞迁移，动物血管生成DFig.5miR-9SOCS5JAK-STATEFig.6miR-9SOCS5JAK1，2STAT1，3GNE-372体外、体内表型微泡解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析图1.检测不同乳腺癌细胞和胞外囊泡中的miR-122表达，分泌的miR-122主要存在于外泌体中，肿瘤细胞内表达无明显差异，推测主要作用于受体细胞解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析图2.在MCF10A中过表达miR-122可以显著改变葡萄糖代谢但对氨基酸代谢无影响，证实miR-122的靶基因是丙酮酸激酶(PKM)和柠檬酸合成酶(CS)，进一步回复实验证实PKM2是核心靶分子g：检测了PKM2的isoforms解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析图3.过表达miR-122位于胞外囊泡中影响受体细胞，肺成纤维细胞接受miR-122后PKM2和GLUT1表达下降，PKM活性降低，葡糖糖摄取显著减少解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析图4.囊泡中的miR-122也能够影响星形胶质细胞的葡萄糖摄取，机制与肺成纤维细胞中一致。而神经元不是miR-122的受体细胞。解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析图5.in vivo（尾静脉注射EV）观察MCF10A和MDA-MB-231囊泡中miR-122过表达对脑和肺部预转移小巢的影响，验证其机制是抑制PKM2和GLUT1，减少葡萄糖摄取解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析图6.利用MCFDCIS细胞验证在肿瘤细胞过表达miR-122的表型：细胞增殖减弱，PKM2和GLUT1表达降低，ATP水平降低。同时脑组织中葡萄糖摄取受抑制，但肺组织无影响；利用MDA-MB-231/122KD稳转株+MCF10A/miR-122EV验证表型，增殖无影响，促进乳腺癌脑、肺转移（K，I，M：rescue）解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析图7.利用MDA-MB-231-HM细胞（内源性高表达miR-122 EV）+anti-miR-122进行in vivo表型和机制验证，结果表明抑制miR-122可恢复脑和肺的葡萄糖摄取，降低乳腺癌转移率解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析乳腺癌PKM2葡萄糖代谢脑、肺转移miR-122科学假设：GLUT1AmiR-122EVsFig.1逻辑思路：BFig.2miR-122EVsPKM2GLUT1CFig.3,4miR-122EVsPKM2-GLUT1肺、脑转移DFig.5miR-122EVsin vivo表型PKM2-GLUT1肺、脑转移Fig.6,7EmiR-122EVs过表达+回复+抑制表型PKM2-GLUT1肺、脑转移解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析肿瘤TLR2/MyD88MDSC外泌体TDEsHsp72科学假设：pSTAT3ATDEspSTAT3Fig.1逻辑思路：BFig.2TDEspSTAT3MDSCIL-6免疫逃逸CFig.3pSTAT3MDSCTDEsIL-6DFig.4pSTAT3MDSCTDEsIL-6TLR2/MyD88ETDEspSTAT3MDSCIL-6TLR2/MyD88Hsp72Fig.5RescueFig.6humanFig.8CTX+DMAFig.7解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析解 螺 旋 课 堂2科 学 假 设 模 式延伸机制疾病临床问题科学热点分子（X）机制（Y）效应（Z）12345囊泡膜蛋白受体B细胞交互临床/科学问题囊泡miRNA细胞A功能解 螺 旋 课 堂2科 学 假 设 模 式提出临床科学问题科学假设前期工作lncRNA蛋白功能AmiRNACB蛋白通路D筛筛circRNAE筛囊泡靶细胞F解 螺 旋 课 堂3标 书 写 作 讲 解案例分析1）题目：肿瘤外泌体中miR-9经由JAK-STAT信号转导调控内皮细胞迁移的分子机制研究1恶性肿瘤发生发展过程中血管新生机制是一个重要的科学问题3）立项依据：Mini-review600-800 字申请人发现内皮细胞中miR-9表达改变，可调节其迁移功能2Mini-review600-800 字miR-9来源于肿瘤外泌体TDEs中，影响血管生成的微环境3Mini-review800-1000 字4miR-9可经由JAK-STAT通路调控肿瘤血管生成的过程Mini-review600-800 字5本项目拟开展工作400 字2）假设：肿瘤JAK-STAT内皮细胞迁移血管生成miR-9TDEs解 螺 旋 课 堂3标 书 写 作 讲 解案例分析4）前期研究基础和本项目拟研究内容：A分子筛选miR-9发现分子B定位于外泌体分子筛选miR-9TDEsC外泌体中miR-9的功能miR-9TDEs内皮细胞迁移D分子信号通路miR-9SOCS5JAK-STATEmiR-9过表达，抑制，RescuemiR-9SOCS5JAK1，2STAT1，3体外、体内表型Rescuehuman解 螺 旋 课 堂3标 书 写 作 讲 解案例分析5）研究内容与研究目的：1 通过miR-9的过表达，抑制和回复实验证实其影响内皮细胞迁移的功能，观察SOCS5/JAK-STAT变化细胞水平2 分子水平对SOCS5，JAK1/2和STAT1/3进行回复验证，解析miR-9/SOCS5/JAK-STAT信号途径的调控特性3 在体内动物模型中分析TDEs中的miR-9对血管生成的作用，并验证SOCS5/JAK-STAT分子信号途径动物水平4 临床水平利用临床肿瘤组织样品分析miR-9/SOCS5/JAK-STAT表达与患者预后的相关性，揭示其临床意义123体外结合体内研究阐明外泌体中的miR-9对于内皮细胞迁移和肿瘤血管新生的作用揭示TDEs中miR-9靶向SOCS5调控内皮细胞JAK-STAT信号通路活性的分子机制明确miR-9表达与肿瘤预后及微血管密度的相关性，验证其下游效应分子变化情况解 螺 旋 课 堂3标 书 写 作 讲 解案例6）研究创新点123TDEs中的miR-9可调控血管内皮细胞迁移鉴定了miR-9/SOCS5/JAK-STAT信号途径TDEs中的miR-9作为肿瘤预后的分子marker7）拟解决关键科学问题123TDEs中的miR-9影响内皮细胞迁移的表型miR-9/SOCS5/JAK-STAT信号途径的调控机制TDEs中的miR-9的临床转化应用价值THANKS2017-1-1