2017年青年项目—LincRNA-p21通过p21及p53通路调控细胞增殖与凋亡参与动脉粥样硬化的分子机制.pdf

申请代码H0215受理部门收件日期受理编号国家自然科学基金国家自然科学基金申请书申请书（2017版）（2017版）资助类别：青年科学基金项目亚类说明：附注说明：项目名称：LincRNA-p21通过p21及p53通路调控细胞增殖与凋亡参与动脉粥样硬化的分子机制研究申 请 人：刘娴电 话：0451-82576785依托单位：哈尔滨医科大学通讯地址：黑龙江省哈尔滨市南岗区学府路194号邮政编码：150081单位电话：0451-86669470电子邮箱：申报日期：2017年02月08日国家自然科学基金委员会（草稿）请于提交后重新下载PDF的正式稿基本信息申请人信息姓名 刘娴性别女出生年月1979年05月民族汉族学位 硕士职称副主任医师每年工作时间（月）10电话 0451-82576785电子邮箱传真国别或地区中国个人通讯地址黑龙江省哈尔滨市南岗区学府路194号工作单位哈尔滨医科大学/哈尔滨医科大学第四临床医学院主要研究领域依托单位信息名称 哈尔滨医科大学联系人 单宏丽电子邮箱电话 0451-86669470网站地址http:/61.158.20.195/合作研究单位信息单位名称项目基本信息项目名称LincRNA-p21通过p21及p53通路调控细胞增殖与凋亡参与动脉粥样硬化的分子机制研究英文名称LincRNA-p21 regulates cell proliferation and apoptosis inatherosclerosis by p21 and p53 pathway资助类别青年科学基金项目亚类说明附注说明申请代码H0215.动脉粥样硬化与动脉硬化H0220.血管发生异常及血管结构与功能异常基地类别研究期限2018年01月01日-2020年12月31日研究方向：动脉粥样硬化与动脉硬化的血管损伤机制申请直接费用 20.0000万元中文关键词中文关键词冠心病；动脉粥样硬化；长非编码RNA英文关键词英文关键词Coronary artery disease;Atherosclerosis;LncRNA（草稿）请于提交后重新下载PDF的正式稿第 1 页国家自然科学基金申请书2017版版本：17110000001019068中文摘要冠状动脉粥样硬化性心脏病（CAD）是当前人类死亡的主要原因之一，而动脉粥样硬化（AS）是导致CAD的主要原因，其发病机制尚未完全阐明。已有多种长链非编码RNA（lncRNA）被发现与CAD及AS存在相关性，在预实验中，本课题组通过lncRNA芯片分析，发现CAD患者外周血样本中lincRNA-p21显著下调，转染lincRNA-p21siRNA可以促进血管平滑肌细胞的增殖同时抑制细胞凋亡。转染lincRNA-p21siRNA后，p21及p53通路相关蛋白Noxa、Bax、Puma的表达显著下调。结合文献报道，我们提出如下假说“lincRNA-p21可以调控p21及p53通路，影响血管平滑肌细胞增殖与凋亡，参与AS过程”。在预实验的基础上，本项目拟通过在细胞模型中通过细胞转染、免疫沉淀技术等实验方法，深入探讨其在AS进程中的作用及相关分子机制，为CAD的治疗寻找新的分子靶点。英文摘要Coronary artery disease(CAD)is a prevailing cause of death worldwide,atherosclerosis(AS)is the leading cause of CAD,and its pathogenesis has notbeen fully studied.As the potential therapeutic targets,many long non-codingRNAs(lncRNAs)are indicated to associate with CAD and AS,but the relativemolecular mechanisms still need further research.In pre-experiments,we foundthat serum samples from CAD patients had lower expression of lincRNA-p21 thancontrol samples by lncRNA chip analysis,and the transfection of lincRNA-p21 siRNAcould promote vascular smooth muscle cell(HUMC)proliferation and inhibit cellapoptosis.Further experiments showed that transfection of lincRNA-p21 siRNA coulddecrease the expressions of p21 and p53 downstream target genes included Noxa,Baxand Puma.Combined with references,we hypothesized that“lincRNA-p21 couldregulate p21 and p53 pathway,affect proliferation and apoptosis of HUMC,andparticipate in the process of AS”.Based on the results of pre-experiments,through cell tranfection,co-immunoprecipitation and other experimental methods,we will further study the relative molecular mechanisms that lincRNA-p21 regulatesHUMC,which provides new molecular targets for the treatment of CAD.（草稿）请于提交后重新下载PDF的正式稿第 2 页国家自然科学基金申请书2017版版本：17110000001019068项目组主要参与者（注:项目组主要参与者不包括项目申请人）编号姓名出生年月性别职 称学 位单位名称电话电子邮箱证件号码每年工作时间（月）1张兰1979-02-10女副教授博士哈尔滨医科大学23060219790210322982顾金霞1978-03-22女副主任医师博士哈尔滨医科大学23232319780322022483曹威1978-04-07女主治医师博士哈尔滨医科大学2301031978040716216总人数高级中级初级博士后博士生硕士生4301（草稿）请于提交后重新下载PDF的正式稿第 3 页国家自然科学基金申请书2017版版本：17110000001019068国家自然科学基金项目资金预算表项目申请号：项目负责人：刘娴金额单位：万元序号科目名称金额备注(1)(2)(3)(1)(2)(3)1一、直接费用20.000021、设备费0.00003(1)设备购置费0.004(2)设备试制费0.005(3)设备改造与租赁费0.0062、材料费15.00 抗体、试剂、试剂盒73、测试化验加工费2.00 PCR引物设计，流式细胞仪84、燃料动力费0.0095、差旅/会议/国际合作与交流费1.00106、出版/文献/信息传播/知识产权事务费1.00117、劳务费1.00直接参加项目研究的研究生的劳务费128、专家咨询费0.0000139、其他支出0.000014二、自筹资金来源0.0000（草稿）请于提交后重新下载PDF的正式稿第 4 页国家自然科学基金申请书2017版版本：17110000001019068预算说明书预算说明书（定额补助）（请按国家自然科学基金项目资金预算表编制说明中的要求，对各项支出的主要用途和测算理由及合作研究外拨资金、单价10万元的设备费等内容进行详细说明，可根据需要另加附页。）项目资金：项目资金：一、直接费用：一、直接费用：20.00万元万元 1、设备费：无、设备费：无 2、材料费：、材料费：15.00万元万元（1）Western blot蛋白检测蛋白检测 6.50万元万元 蛋白抽提试剂：500元/支6支=3000元 BCA蛋白定量试剂盒：300元/支10支=3000元 蛋白分子标准品：500元/支6支=3000元 一抗抗体：3000元/支8支=24000元 二抗抗体：1000元/支8支=8000元 SDS、TBST：100元/份20分=2000元 PVDF膜：1000元/张5张=5000元 化学发光试剂：1000元/瓶5瓶=5000元 PAGE胶：1000元/瓶5瓶=5000元 TBST等其他试剂：7000元（2）RT-PCR检测检测 2.50万元万元 RNA抽提试剂盒：1000元/份7份=7000元 RNA反转录试剂盒：500元/份8份=4000元 RT-PCR扩增试剂盒：2000元/份7份=14000元（3）细胞培养与转染实验）细胞培养与转染实验 1.00万元万元 胎牛血清：5000元/瓶1瓶=5000元 抗生素等其他试剂：5000元（4）其他试剂盒）其他试剂盒 2.50万元万元 RIP试剂盒：2000元/份5份=10000元 RNA pull down试剂盒：1000元/份5份=5000元 ChIP试剂盒：1000元/份5份=5000元 Co-IP试剂盒：1000元/份5份=5000元（5）耗材费）耗材费 2.50万元万元 移液器枪头（0.01ml）：100元/包50包=5000元 移液器枪头（0.2ml）：100元/包50包=5000元 移液器枪头（1ml）：100元/包50包=5000元 EP管：100元/包50包=5000元 冻存盒（81孔）：20元/个250个=5000元 3、测试化验加工费：、测试化验加工费：1.00万元万元（1）基因引物设计费：200元/个10个=2000元（2）流式细胞仪检测：200元/次40次=8000元 4、燃料动力费：无、燃料动力费：无 （草稿）请于提交后重新下载PDF的正式稿第 5 页国家自然科学基金申请书2017版版本：17110000001019068 预算说明书预算说明书（定额补助）（请按国家自然科学基金项目资金预算表编制说明中的要求，对各项支出的主要用途和测算理由及合作研究外拨资金、单价10万元的设备费等内容进行详细说明，可根据需要另加附页。）5、差旅、差旅/会议会议/国际合作与交流费：国际合作与交流费：1.00万元万元 2人次/年，每次2000-3000元，共2年，合计：25002人次/年2年=10000元 6、出版、出版/文献文献/信息传播信息传播/知识产权失误费：知识产权失误费：2.00万元万元 发表中英文期刊论文2-3篇，每篇版面费2000元，合计：5000元 发表SCI论文1-2篇，每篇版面费10000元，合计：15000元 7、劳务费：、劳务费：1.00万元万元 一个硕士生，20个月，每人500/月，合计：10000元 8、专家咨询费：无专家咨询费：无 9、其他支出：无、其他支出：无 二、自筹资金来源：无二、自筹资金来源：无 （草稿）请于提交后重新下载PDF的正式稿第 6 页国家自然科学基金申请书2017版版本：17110000001019068报告正文报告正文 参照以下提纲撰写，要求内容翔实、清晰，层次分明，标题突出。请勿删除或改动下述提纲标题及括号中的文字。请勿删除或改动下述提纲标题及括号中的文字。（一）立项依据与研究内容（一）立项依据与研究内容（4000-8000 字）：1项目的立项依据项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）；冠状动脉粥样硬化性心脏病，简称冠心病（coronary artery disease，CAD），已成为严重威胁公共健康的疾病之一(1)。尤其在我国，由于社会经济快速发展、人口老龄化、以及饮食结构调整等原因，冠心病的发病率及死亡率逐年上升并呈现年轻化趋势(2)。大量病因学研究表明，冠心病的发生发展与吸烟、饮酒、高血压、糖尿病、肥胖、血脂异常、及遗传因素有关(3)。目前针对冠心病的治疗方法，主要包括调脂治疗，以及以冠状动脉旁路搭桥手术或经皮冠状动脉介入术后联合抗凝和（或）抗血小板治疗为代表的血运重建，但是冠心病患者的死亡率依然较高(4)。据世界卫生组织估算，我国每年约有超过 100 万人死于冠心病，因此进一步研究前冠心病的发病机制，寻找新的诊疗分子靶点就具有更加重要的现实意义和理论价值(2)。其中，动脉粥样硬化是冠心病重要的病理过程，其发生发展与血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的增殖及血管内膜细胞的功能改变密切相关，深入研究动脉粥样硬化相关的分子机制，可以为冠心病的治疗提供新的可能(5)。（草稿）请于提交后重新下载PDF的正式稿第 7 页国家自然科学基金申请书2017版版本：17110000001019068图图 1、人类基因组的转录本中包含多种非编码、人类基因组的转录本中包含多种非编码 RNA。H1 RNA：核糖核酸酶 P 的RNA 组件；miRNAs：微小 RNAs；mRNA：信使 RNA；mtRNA：线粒体 RNA；piRNAs：piwi 相关 RNA；RMRP：RNA 酶 MRP 的 RNA 组件；rRNA：核糖体RNA；scaRNAs：small Cajal body-specific RNAs；7SL RNA：信号识别 RNA；snoRNAs：小核仁 RNA；snRNAs：小核内 RNA；TERC：端粒酶 RNA 组件；tRNAs：转运 RNA；Y RNAs：RoRNA 组件。在人类基因组中，约有 93%的 DNA 序列可以被转录为 RNA，但是其中仅有不到 2%的核酸序列被用于编码蛋白质，其余的转录产物均为不编码蛋白质的非编码 RNA（non-coding RNA，ncRNA）(6)。非编码 RNA 广泛存在于各种生物中，主要包括：piRNA（Piwi-interacting RNA）、gRNA（guide RNA）、miRNA（microRNA）、及 lncRNA（long noncoding RNA）等（图 1）(7)。在众多类型的非编码 RNA 中，针对长度为 18-24nt 的 miRNA 的研究较为深入，并发现其在多种生物及病理过程的基因表达调控中发挥重要作用(8)。此外，长度在200-100000nt 之间长链非编码 RNA（long non-coding RNA,lncRNA）及其亚型基因间长链非编码 RNA（Long intergenic non-coding RNA，lincRNA）是近几年发现的一类具备生物学功能的非编码 RNA(9)。LncRNA 一度被认为是转录过程中的“噪音”，不具备生物学功能，但随着深入的研究后发现，lncRNA 具有组织或细胞特异性表达、特定的亚细胞定位、局部高度保守的序列元件以及特殊的空间二级结构，能以 RNA 的形式参与机体重要的生物学过程，包括：与蛋白质相互作用、形成内源性 siRNA、调控 mRNA 剪切、染色质重塑及组蛋白重塑、转录调节等（图 2）(10,11)。已有文献表明，lncRNA 可以以 RNA 的形式在多重层面上（表观遗传调控、转录调控及转录后调控），在肿瘤的发生发展过程中发挥重要的作用(12,13)。例如，HOTAIR、MALAT1 和 UCA1 等 lncRNAs 可作为促癌基因参与肿瘤调节，而另外一些 lncRNA 如 LOC285194、GACAT1 和 Dreh可抑制肿瘤的发生发展(14-19)。但是，研究 lncRNA 在心血管系统疾病中作用的文献依然较少。有研究表明，一个位于人染色体 9p21.3 上的 lncRNA ANRIL 与冠心病的患病风险性显著相关，同时 ANRIL 可以通过调控 NF-kappaB 通路影响血管内膜细胞的炎症反应(20)。此外，近期的一项研究鉴定出了一个名为（草稿）请于提交后重新下载PDF的正式稿第 8 页国家自然科学基金申请书2017版版本：17110000001019068CoroMarker 的 lncRNA，其在冠心病患者的外周血样本中表达显著上调(21)。尽管如此，lncRNA 在冠心病等心血管系统疾病中的作用及相关分子机制仍需要进一步的研究。我们在预实验中，通过通过 lncRNA 芯片分析的方法，比较冠心病患芯片分析的方法，比较冠心病患者与健康对照的外周血样本中者与健康对照的外周血样本中 lncRNA 的表达水平，发现冠心病患者外周血样的表达水平，发现冠心病患者外周血样本中有多种本中有多种 lncRNA 存在异常表达（详见工作基础），提示存在异常表达（详见工作基础），提示 lncRNA 在冠心病的在冠心病的发生发展过程中发挥重要作用发生发展过程中发挥重要作用。图图 2、LncRNAs 通过多种途径发挥调控作用。通过多种途径发挥调控作用。A）LncRNAs 参与 DNA 甲基化调控。B）LncRNAs 可以顺式调控使组蛋白甲基化。C）LncRNAs 可以反式调控使组蛋白甲基化。D）LncRNAs 影响核小体的定位。E）LncRNAs 可以在转录水平抑制基因表达。F）LncRNAs 影响转录因子与 DNA 的结合。G）LncRNAs 影响染色体的三维结构。H）LncRNAs 可以通过剪切形成 miRNAs。I）LncRNA 可以作为 miRNA 的分子海绵与 miRNA 结合。J）LncRNA 可以在翻译水平影响基因表达。5mC:5 甲基胞嘧啶。Huarte 等基于 p53 条件性敲除的小鼠胚胎细胞，采用高通量芯片筛选的方法，筛选与 p53 表达相关的基因及 lncRNA，首次发现并报道了一种与 p53 表达显著相关的 lncNRA，并命名为 lincRNA-p21(22)。LincRNA-p21 的编码区位于 p21（草稿）请于提交后重新下载PDF的正式稿第 9 页国家自然科学基金申请书2017版版本：17110000001019068基因位点上游，成熟的 lincRNA-p21 长度为 3073nt，在细胞核和细胞质中均有分布(23)。现有针对 lincRNA-p21 的报道主要集中在 lincRNA-p21 在肿瘤中的相关机制研究，而对于 lincRNA-p21 在不同病理进程中的相关分子机制还需要进一步的研究。在预实验中，lncRNA 芯片分析结果显示冠心病患者外周血组织中lincRNA-p21 的表达水平较健康对照组显著下调，为验证芯片分析结果，我们通过 RT-PCR 的方法在外周血样本中进行了回顾性验证。同时，我们构建了 ApoE-/-动脉粥样硬化小鼠模型，RT-PCR 结果显示模型组小鼠粥样硬化斑块组织中lincRNA-p21 的表达显著下调。以上结果表明：lincRNA-p21 与动脉粥样硬化存与动脉粥样硬化存在相关性在相关性。LincRNA-p21 可以通过多种作用机制发挥调控作用可以通过多种作用机制发挥调控作用（图 3）(24)。例如，缺氧条件下，lincRNA-p21 可以作为缺氧反应 lncRNA 影响 HIF-1 表达进而参与Warburg 效应，lincRNA-p21 与 HIF-1 形成反馈通路发挥调控作用(25)。另一项研究表明，敲除维生素 D 下调 lincRNA-p21 表达可能与皮肤角质细胞的过度增殖及皮肤癌的形成之间存在相关性(26)。此外，lincRNA-p21 在结肠癌、前列腺癌、慢性淋巴性白血病患者组织中异常表达，提示 lincRNA-p21 可能是癌症诊断及治疗的潜在靶点(27-29)。除了参与肿瘤相关的调控过程，lincRNA-p21 也参与其他疾病的发病过程。例如，类风湿关节炎患者组织样本中 lincRNA-p21 水平显著下调并伴随 NF-kB 的活化，而氨甲喋呤可以通过上调 lincRNA-p21 的表达水平来抑制 NF-kB 的活化，提示 lincRNA-p21 可能在类风湿性关节炎的病理过程中起到重要的调控作用(30)。在预实验中，抑制 lincRNA-p21 表达可以促进血管平滑肌细胞的增殖同时抑制细胞的凋亡。同时，血管线损伤小鼠模型实验结果显示，抑制lincRNA-p21表达可以促进损伤区血管内膜细胞的增殖同时抑制细胞的凋亡（见工作基础）。预实验结果表明预实验结果表明 lincRNA-p21 可能通过可能通过影响血管平滑肌细胞及影响血管平滑肌细胞及血管内膜细胞的增殖与凋亡参与动脉粥样硬化的调控，对其具体分子作用机制血管内膜细胞的增殖与凋亡参与动脉粥样硬化的调控，对其具体分子作用机制的研究即为课题的主要研究目标的研究即为课题的主要研究目标。（草稿）请于提交后重新下载PDF的正式稿第 10 页国家自然科学基金申请书2017版版本：17110000001019068 图图 3、LincRNA-p21 通过多种分子机制发挥调控作用。通过多种分子机制发挥调控作用。细胞增殖与细胞周期紧密相关，而细胞周期受到多种特异性的细胞因子调控，其中细胞周期依赖性蛋白激酶（cyclin-dependent kinases，CDK）以及 CDK激酶抑制因子发挥重要的作用(31)。P21（又名 CDKN1a、p21WAF1/cip1、p21 WAF1）是一个 CDK 激酶抑制因子，属于 Cip/Kip CDK 激酶抑制因子家族(32)。P21 有两个不重叠的结构域，包括氨基端的 CDK-cyclin 抑制结构域及羧基端的PCNA 结合结构域(33)。目前的研究显示，p21 在癌症中具有多种活性，可以通过多种信号通路调控肿瘤细胞的细胞周期。通过氨基端的结构域，p21 可以抑制CDK2 的活性，抑制 RB 蛋白的磷酸化，进而抑制转录因子 E2F1 的转录活性并引起 G1/S 期阻滞；p21 也可以抑制 CDK1 激酶活性并引起 G2/M 期阻滞(34,35)。同时，通过羧基端的结构域，p21 可以与细胞增殖核抗原（proliferating-cell nuclear antigen，PCNA）结合从而抑制 PCNA 依赖的 DNA 修复及 DNA 复制，并引起细胞的 S 期阻滞(36)。除了参与肿瘤细胞的细胞周期调控，p21 的正常表达在维持 VSMC 非增殖状态的过程中起重要作用，紫外线辐射及血管损伤等因素可以通过抑制 p21 表达诱导 VSMC 增殖，而部分抑制 VSMC 增殖因子可以通过促进p21 发挥作用(37)。在预实验中，我们对转染了 lincRNA-p21 siRNA 的 VSMC 及对照组细胞进行了 mRNA 芯片分析，结合 KEGG 数据库 GO 分析后发现转染lincRNA-p21 siRNA 的细胞中 p21 表达显著降低，经过 RT-PCR 及 Western blot（草稿）请于提交后重新下载PDF的正式稿第 11 页国家自然科学基金申请书2017版版本：17110000001019068回顾性验证后，确认下调下调 lincRNA-p21 可以降低可以降低 p21 的表达水平的表达水平。P53 是定位于细胞核的抑制细胞增殖的抑癌因子，其编码基因定位于人染色体 17p13.1，全长 20kb，共编码 393 个氨基酸(38)。P53 蛋白从氨基端到羧基端包括两个转录激活结构域（transcriptional activation domains，TAD）、一个富含脯氨酸的结构域（proline-rich domain，PRD）、一个DNA结合结构域（DNA-binding domain）、一个四聚体寡聚化结构域（tetramerization domain，TET）和一个非专一 DNA 调节结构域（regulatory domain，REG）(39)。当细胞接受 DNA 损伤、活性氧及缺氧等信号刺激时，p53 蛋白会发生相应的修饰，包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等，活化并激活下游信号通路(40)。P53 通过多种机制抑制肿瘤形成，包括阻滞细胞周期、修复DNA损伤、激活细胞凋亡及自噬，其中p53-MDM2负反馈调节通路是 p53 重要的调控机制之一(41)。小鼠双微体蛋白 2（Mouse Double Minute 2，MDM2）及 p300 可以与 p53 蛋白组成复合物，p300 可以通过对 p53 进行乙酰化修饰从而提高 p53 的转录活性，而 MDM2 可以通过其 E3 泛素化连接酶活性通过泛素化-蛋白酶体途径降解 p53 蛋白(42,43)。此外，MDM2也可以通过抑制 p53 与 p300 的结合，降低 p53 的乙酰化水平进而降低 p53 的转录活性，而 MDM2 本身是 p53 激活的一个靶基因分子，因此构成了一个负反馈调节通路(44)。除了调控肿瘤细胞的细胞凋亡，p53 还与心血管疾病密切相关，例如，有研究报道 p53 的失活可以明显加速动脉粥样硬化的发生发展(45)。预实验中，mRNA 芯片分析结果显示，转染 lincRNA-p21 siRNA 后，p53 通路相关蛋白 Noxa、Bax、Puma 的 mRNA 表达显著下调，随后通过 RT-PCR 及 Western blot进行了回顾性验证。此外，通过生物信息学分析，我们发现 lincRNA-p21 可能与MDM2 之间存在靶向结合作用，因此 lincRNA-p21 可能通过可能通过“p53-MDM2 负反馈负反馈通路通路”调控调控 p53 通路表达通路表达。同时，由于 lincRNA-p21 本身收到 p53 的正性调控，因此我们猜测我们猜测 lincRNA-p21 与与 p53 可以形成反馈通路（可以形成反馈通路（图图 4），调控），调控 VSMC 细胞细胞增殖、凋亡及动脉粥样硬化进程增殖、凋亡及动脉粥样硬化进程。（草稿）请于提交后重新下载PDF的正式稿第 12 页国家自然科学基金申请书2017版版本：17110000001019068 图图 4、LincRNA-p21 参与参与 p53-MDM2 负反馈通路。负反馈通路。P300 可以通过对 p53 进行乙酰化修饰从而提高 p53 的转录活性，MDM2 可以通过抑制 p53 与 p300 的结合，降低 p53 的乙酰化水平进而降低 p53 的转录活性。lincRNA-p21 可以通过结合MDM2，抑制 MDM2 对 p53 转录活性的作用。P53 在调控 lincRNA-p21 的同时，也调控 p21 的转录，由于 lincRNA-p21 也参与 p21 表达的调控，因此我们猜测 lincRNA-p21 可能参与 p53 调控 p21 转录的过程(46)。结合预实验结果，我们提出如下假说结合预实验结果，我们提出如下假说：lincRNA-p21 可以通过可以通过调控调控 p21及及 p53 通路，影响血管平滑肌细胞增殖与自噬，参与动脉粥样硬化进程通路，影响血管平滑肌细胞增殖与自噬，参与动脉粥样硬化进程。在预实验的工作基础上，本课题拟从病理回归分析中总结 lincRNA-p21 与冠心病的相关性。同时，通过细胞转染、RNA 免疫沉淀（RIP）、染色质免疫沉淀（ChIP），RNA pulldown 等技术在血管平滑肌细胞中进一步探讨目标分子在动脉粥样硬化过程中细胞增殖及凋亡的作用方式及相关调控分子机制，验证lincRNA-p21-p53 反馈通路及 p53-lincRNA-p21-p21 通路的作用。以上研究在病例及细胞层面展开，深入研究冠心病相关的分子机制，为进一步理解冠心病的发病机制以及为冠心病的诊疗靶点选择提供新的理论依据。主要参考文献 1.Aggarwal A,Srivastava S,Velmurugan M.Newer perspectives of coronary artery（草稿）请于提交后重新下载PDF的正式稿第 13 页国家自然科学基金申请书2017版版本：17110000001019068disease in young.World journal of cardiology.2016;8(12):728-34.2.Geriatrics Branch of Chinese Medical A,Editorial Board of Chinese Journal of Internal M,Editorial Board of Chinese Journal of G.Aspirin use in patients with atherosclerotic cardiovascular disease:the 2016 Chinese expert consensus statement.Zhonghua nei ke za zhi.2017;56(1):68-80.3.Bundhun PK,Soogund MZ,Huang WQ.Same Day Discharge versus Overnight Stay in the Hospital following Percutaneous Coronary Intervention in Patients with Stable Coronary Artery Disease:A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials.PloS one.2017;12(1):e0169807.4.Lee DH,Chun EJ,Hur JH,Min SH,Lee JE,Oh TJ,et al.Effect of sarpogrelate,a selective 5-HT2A receptor antagonist,on characteristics of coronary artery disease in patients with type 2 diabetes.Atherosclerosis.2016;257:47-54.5.Goodfellow VS,Settineri M,Lawton RG.p-Nitrophenyl 3-diazopyruvate and diazopyruvamides,a new family of photoactivatable cross-linking bioprobes.Biochemistry.1989;28(15):6346-60.6.Dangwal S,Schimmel K,Foinquinos A,Xiao K,Thum T.Noncoding RNAs in Heart Failure.Handbook of experimental pharmacology.2016.7.Non-coding RNA-from useless to essential.Casopis lekaru ceskych.2016;155(7):370-6.8.Chen YT,Wang J,Tong KS,Wong LL,Liew OW,Richards AM.The association of heart failure-related microRNAs with neurohormonal signaling.Biochimica et biophysica acta.2017.9.Groff AF,Sanchez-Gomez DB,Soruco MM,Gerhardinger C,Barutcu AR,Li E,et al.In Vivo Characterization of Linc-p21 Reveals Functional cis-Regulatory DNA Elements.Cell reports.2016;16(8):2178-86.10.Busch A,Eken SM,Maegdefessel L.Prospective and therapeutic screening value of non-coding RNA as biomarkers in cardiovascular disease.Annals of translational medicine.2016;4(12):236.11.Greco S,Gorospe M,Martelli F.Noncoding RNA in age-related cardiovascular diseases.Journal of molecular and cellular cardiology.2015;83:142-55.12.Aguilo F,Di Cecilia S,Walsh MJ.Long Non-coding RNA ANRIL and Polycomb in Human Cancers and Cardiovascular Disease.Current topics in microbiology and immunology.2016;394:29-39.13.Wan X,Ding X,Chen S,Song H,Jiang H,Fang Y,et al.The functional sites of miRNAs and lncRNAs in gastric carcinogenesis.Tumour biology:the journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine.2015;36(2):521-32.14.He H,Wei Z,Du F,Meng C,Zheng D,Lai Y,et al.Transcription of HOTAIR is regulated by RhoC-MRTF-A-SRF signaling pathway in human breast cancer cells.Cellular signalling.2017.15.Li P,Zhang X,Wang H,Wang L,Liu T,Du L,et al.MALAT1 is associated with poor response to oxaliplatin-based chemotherapy in colorectal cancer patients and promotes chemoresistance through EZH2.Molecular cancer therapeutics.2017.16.Liu H,Wang G,Yang L,Qu J,Yang Z,Zhou X.Knockdown of Long（草稿）请于提交后重新下载PDF的正式稿第 14 页国家自然科学基金申请书2017版版本：17110000001019068Non-Coding RNA UCA1 Increases the Tamoxifen Sensitivity of Breast Cancer Cells through Inhibition of Wnt/beta-Catenin Pathway.PloS one.2016;11(12):e0168406.17.Correction to Authors Name in:Antisense Long Noncoding RNA LOC285194 is Downregulated in NSCLC and Associated With Poor Prognosis.Chest.2016;150(1):261.18.Xiao B,Guo J.Long noncoding RNA AC096655.1-002 has been officially named as gastric ca