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NSFC案例精讲班(八)解螺旋课堂2017酸菜解 螺 旋 课 堂0课 程 内 容文献案例分析科学假设模式132标书写作讲解解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析A.5株膀胱癌细胞评价多药耐药的实验策略（5637，T24，EJ，H-bc，Biu87）B.测试4种化疗药物的IC50（Pi，Pa，Ad，EH）C.耐药数据归一化解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析A.miRNA组学筛选和验证策略B.差异变化最为显著的miRNA热图C.qRT-PCR验证结果D.归一化数据表E.miR-193a-3p启动子区CpG岛甲基化F.甲基化测序结果G.CpG岛甲基化比例H.CpG岛甲基化数据柱形图解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析A.miR-193a-3p靶基因验证实验策略B.测序结果中SRSF2,HIC2 and PLAU的表达C.qRT-PCR检测SRSF2,HIC2 and PLAU表达D.SRSF2,HIC2 and PLAU表达Western结果E.miR-193a-3p过表达和沉默，靶蛋白表达F.miR-193a-3p过表达，靶基因mRNA表达G.荧光素酶报告载体构建策略H.PLAU基因荧光素酶报告系统验证结果I.HIC2基因荧光素酶报告系统验证结果解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析A.实验策略图B.化疗药物处理后细胞IC50（3pvs.5p）C.miR-193a-3p vs.5p靶基因蛋白表达D.miR-193a-3p vs.5p抑制剂处理IC50E.抑制剂处理3p vs.5p靶基因蛋白表达F.G图的数据做柱形图分析G.siRNA抑制下游靶基因表达Western结果H.siRNA抑制下游靶基因实验IC50结果I.siRNA抑制下游靶基因实验蛋白WesternJ.变化趋势总结K.下游靶基因过表达耐药表型验证解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析A.实验策略图B.PathwayArray分析7条通路受调控C.7条通路数据归一化D.通路中靶基因表达数据E.STRING调控网络图解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析A.实验策略图B.裸鼠成瘤典型图片C.瘤重数据图D.瘤重数据表E.靶基因免疫组化染色结果解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析逻辑思路：A膀胱癌细胞耐药Fig.1CFig.3miR-193a-3pSRSF2,PLAU and HIC2 DmiR-193a-3p vs.5pFig.4膀胱癌细胞耐药EmiR-193a-3pSRSF2,PLAU and HIC2 Fig.5下游分子调控网络BFig.2耐药细胞miROmics甲基化miR-193a-3pFFig.6动物实验验证miR-193a-3p vs.5p解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析图1.建立PRL-3稳转AML细胞株A.细胞荧光表达B.PRL-3mRNA和蛋白表达C.稳转株不依赖IL-3D.克隆形成能力E.裸鼠成瘤解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析图2.筛选和验证PRL-3过表达之后受到调控的蛋白A.典型蛋白Western结果B.用另外两株AML细胞株进行调控验证C.Leo1受到PRL-3剂量依赖的调控（过表达）D.Leo1受到PRL-3剂量依赖的调控（siRNA）解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析图3.在PRL-3稳转株中沉默Leo1表达的效果A.在PRL-3稳转株中沉默Leo1的mRNA和蛋白B.在PRL-3稳转株中沉默Leo1的细胞生长曲线C.在PRL-3稳转株中沉默Leo1的细胞凋亡结果D.在PRL-3稳转株中沉默Leo1的克隆形成结果解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析图4.人AML组织标本表达和原代细胞siRNA表型验证A.24例标本的PRL-3和Leo1表达情况B.在AML原代细胞中转染siRNA沉默PRL-3C.在AML原代细胞中应用siRNA观察生长抑制情况解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析图5.PRL-3通过组蛋白H3K9调控Leo1的转录水平A.沉默PRL-3能够抑制Leo1 mRNAB.荧光素酶报告系统显示Leo1的启动子活性受到PRL-3剂量依赖式调控C.PRL-3调控H3K9二甲基化和三甲基化D.Leo1启动子甲基化受到PRL-3调控解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析图6.PRL-3经由JMJD2C调节Leo1的转录A.沉默JMJD2家族四个成员的mRNAB.JMJD2C调控H3K9me3影响Leo1表达C.在PRL-3稳转株中沉默JMJD2CD.影响H3K9me3与Leo1启动子区结合E.PRL-3表达显著影响JMJD2C在Leo1启动子P2的结合解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析图7.Leo1沉默影响了PAF复合物稳定性A.沉默Leo1下调Ctr9,Paf1,Ski8的mRNAB.沉默Leo1下调Ctr9和Paf1蛋白表达C.沉默Leo1下调Sox2,Sox4,Tbx3mRNAD.沉默PRL-3普遍下调PAF复合物组分蛋白E.沉默PRL-3的效果可以被Leo1回复解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析逻辑思路：APRL-3稳转细胞株Fig.1CFig.3PRL-3稳转株Leo1回复DPRL-3Fig.4Leo1EPRL-3H3K9me3Fig.5Leo1BFig.2PRL-3稳转株蛋白组学Leo1FJMJD2CPRL-3细胞表型组织标本，原代细胞H3K9me3Leo1Fig.6GJMJD2CPRL-3H3K9me3Leo1Fig.7PAF complex12345GST pull-down+MSRNA pull-down+MSRNA ImmunoprecipitationRNA-蛋白相互作用DNA-蛋白相互作用蛋白-蛋白相互作用miRNA靶基因NGS/GenechipDNA/RNA筛选解 螺 旋 课 堂1文 献 案 例 分 析SILAC-MS蛋白筛选解 螺 旋 课 堂2科 学 假 设 模 式延伸机制疾病临床问题科学热点分子（X）机制（Y）效应（Z）12345甲基化酶临床/科学问题靶基因组蛋白通路功能表型解 螺 旋 课 堂2科 学 假 设 模 式提出临床科学问题科学假设前期工作lncRNA蛋白miR-蛋白功能1筛miRNA蛋白功能2筛circRNAmiR-蛋白功能3筛囊泡4筛蛋白可变剪切功能5解 螺 旋 课 堂2科 学 假 设 模 式提出临床科学问题科学假设前期工作蛋白可变剪切功能5蛋白磷酸化乙酰化泛素化功能6转录因子功能7甲基化蛋白ncRNAs功能8蛋白ncRNAs解 螺 旋 课 堂3标 书 写 作 讲 解案例（一）1）题目：PPAR的DNA甲基化在糖尿病视网膜病变中的作用及机制研究1糖尿病视网膜病变的临床现状和治疗困境3）立项依据：Mini-review600-800 字高糖刺激下的氧化应激效应是视网膜病变发生的重要因素2Mini-review600-800 字申请人前期筛选其中参与调控的甲基化位点，发现PPAR3Mini-review600-800 字4PPAR研究背景以及调控氧化应激的潜在信号通路机制Mini-review600-800 字5本项目拟开展工作400 字2）假设：糖尿病视网膜病变氧化应激DNA甲基化PPAR解 螺 旋 课 堂3标 书 写 作 讲 解4）研究内容与研究目的：3 123揭示PPAR在调节氧化应激上的功能解析PPAR的甲基化位点和下游信号通路在体水平验证PPAR甲基化调控在糖尿病视网膜病变中的表型与机制1 PPAR的过表达/沉默，观察其对细胞氧化应激和增殖、凋亡表型的影响细胞水平2 分子水平1）阐明PPAR启动子区的甲基化位点；2）PPAR下游介导的信号通路3 动物水平在糖尿病视网膜病变动物模型中验证PPAR的甲基化水平，下游分子信号途径和氧化应激表型案例（一）解 螺 旋 课 堂3标 书 写 作 讲 解5）特色与创新1糖尿病视网膜病变中PPAR的DNA甲基化2PPAR在糖尿病视网膜病变中调节氧化应激作用3PPAR在糖尿病视网膜病变中介导的信号通路6）拟解决关键科学问题12PPAR在糖尿病视网膜病变中的功能表型PPAR在糖尿病视网膜病变中的分子信号途径案例（一）解 螺 旋 课 堂3标 书 写 作 讲 解案例（二）1）题目：组蛋白去甲基化酶KDM4C调控神经母细胞瘤增殖和代谢的分子机制研究1神经母细胞瘤的临床问题，发病机制研究进展3）立项依据：Mini-review600-800 字组蛋白甲基化这种表观遗传学机制在疾病发生中的重要角色2Mini-review400-600 字申请人前期聚焦于组蛋白去甲基化酶在疾病中的功能3Mini-review800-1000 字4进一步研究发现KDM4C在神经母细胞瘤中的调节通路Mini-review600-800 字5本项目拟开展工作400 字2）假设：神经母细胞瘤增殖/代谢组蛋白甲基化KDM4C解 螺 旋 课 堂3标 书 写 作 讲 解4）特色与创新1神经母细胞瘤中KDM4C承担的功能角色2KDM4C调控的组蛋白甲基化位点3KDM4C对增殖和代谢调控的信号通路案例（二）5）拟解决关键科学问题12鉴定KDM4C在神经母细胞瘤中的功能作用明确KDM4C对组蛋白去甲基化调节的位点3挖掘KDM4C在神经母细胞瘤中调控的分子信号途径THANKS2017-1-15