实时荧光定量PCR具体实验步骤.doc

实时荧光定量PCR具体实验步骤 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。 ① 浓度测定 A260下读值为1表示40 µg RNA/ml。样品RNA浓度(µg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 µg/ml。具体计算如下： RNA溶于40 µl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495µl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 µg/ml = 840 µg/ml 或 0.84 µg/µl 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 µl，剩余RNA总量为： 35 µl × 0.84 µg/µl = 29.4 µg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度  成分 0.4M  MOPS，pH 7.0 0.1M  乙酸钠 0.01M  EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 µl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。 ②准备RNA样品 取3µgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10µg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。 ③电泳 上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5–6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。 ④紫外透射光下观察并拍照 28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。 3样品cDNA合成 ①反应体系 序号  反应物  剂量 1  逆转录buffer  2μl 2  上游引物  0.2μl 3  下游引物  0.2μl 4  dNTP  0.1μl 5  逆转录酶MMLV  0.5μl 6  DEPC水  5μl 7  RNA模版  2μl 8  总体积  10μl 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。 ②混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。 ③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。 4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR ①β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3μl按10倍稀释（加水27μl并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。 ②反应体系如下： 标准品反应体系 序号  反应物  剂量 1   SYBR Green 1 染料  10μl 2  阳性模板上游引物F  0.5μl 3  阳性模板下游引物R  0.5μl 4  dNTP  0.5μl 5  Taq酶  1μl 6  阳性模板DNA  5μl 7  ddH2O  32.5μl 8  总体积  50μl 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。 管家基因反应体系： 序号  反应物  剂量 1  SYBR Green 1 染料  10μl 2  内参照上游引物F  0.5μl 3  内参照下游引物R  0.5μl 4  dNTP  0.5μl 5  Taq酶  1μl 6  待测样品cDNA  5μl 7  ddH2O  32.5μl 8  总体积  50μl 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。 ③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃　2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。 5 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板 ①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。 反应体系： 序号  反应物  剂量 1  10× PCR缓冲液  2.5 ul 2  MgCl2 溶液  1.5 ul 3  上游引物F  0.5 ul 4  下游引物R  0.5 ul 5  dNTP混合液  3 ul 6  Taq聚合酶  1 ul 7  cDNA  1 ul 8  加水至总体积为  25ul 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。 35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）； 72ºC延伸5分钟。 ②PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。 ③将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。 6 待测样品的待测基因实时定量PCR ①所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。 体系配置如下： 序号  反应物  剂量 1  SYBR Green 1 染料   10 ul 2  上游引物  1ul 3  下游引物  1ul 4  dNTP   1ul 5  Taq聚合酶  2ul 6  待测样品cDNA  5ul 7  ddH2O   30ul 8  总体积  50 ul 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。 ②将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。 7 实时定量PCR使用引物列表 引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。 8 电泳 各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView™染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。