目的基因PCR扩增产物的克隆.doc

目的基因PCR扩增产物的克隆 [实验原理] 1.PCR产物回收 在高离子盐存在的情况下，DNA片断选择性的吸附于离心柱内的硅基质膜上，再通过一系列快速的漂洗、离心的步骤去蛋白液和漂选液，将引物、核苷酸、蛋白酶等杂质去除，最后用低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净DNA从硅基质膜上洗脱。 2.T载体与PCR产物的连接 源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。因为DNA片断有两个端点，所以切割时出现两种可能，一种是单酶切，另一种是双酶切，这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。对于单酶切来说，载体与供体的末端都相同，连接可以在任何末端之间进行，这样就导致了大量的自连接产物。为了减少自环的高本底，可对载体进行5’除磷酸处理，原理是连接酶只能连接DNA片断的3’OH末端与5’端，所以除磷后载体不会自环。一旦有外源片断插入时，由外源片断提供5’端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自身成环造成的高本底。对于双酶切来说，无论载体与供体同一片段上都有不同的末端，这样就避免了载体与供体的自环，能使有效连接产物大大增加。双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。 连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。Taq DNA酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与T -Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。 [实验材料、试剂和仪器] PCR扩增相关试剂、PCR仪、移液枪、低温离心机、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、PCR产物回收试剂盒、pUCm-T载体。 [实验步骤] 10×PCR Buffer 2.5 μl dNTPs 0.5 μl Taq 0.2 μl 引物1 1.5 μl 引物2 1.5 μl ddH20 17.3 μl DNA模板 1.5 μl 1．PCR扩增 　　PCR反应体系： 　　　 注：每组做5管，其中4管用于PCR产物回收，1管作电泳检测时的对照 PCR反应程序： 1 94℃预变性　 5min 2 94℃变性 45s 3 60℃退火 30s 4 72℃延伸 60s 2－4步骤，35循环 5 72℃延伸 10min 6 4℃ 保存 2．目的基因PCR扩增产物的琼脂糖电泳检测 （1）制备琼脂糖凝胶 称取0.2g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入20ml 1.0×TBE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液。 （2）取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙）。 （3）将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。 （4）将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。 （5）待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放在电泳槽内。 （6）加入电泳缓冲液至电泳槽中。 （7）用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔中（记录点样顺序及点样量）。 （8）接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处，停止电泳。 3．产物回收 （1）在紫外光下将琼脂糖凝胶上的目的片段切下，放入1.5 mL Eppendorf离心管中；加入500μl溶胶/结合液DB，充分混匀。 （2）将上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），室温放置1 min，12000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液。 （3）加入700μl漂洗液WB，12000rpm离心1min，弃掉废液。 （4）加入500μl漂洗液WB，12000rpm离心1 min，弃掉废液。 （5）将吸附柱AC放回空收集管中，12000rpm离心2 min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。 （6）取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中加热效果更好），室温放置2 min，12000rpm离心1 min。如果需要较多量DNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱，离心1 min。 4．PCR产物与T载体的连接 对于常规的DNA ligase连接反应，请参考下面的连接反应体系，或按DNA ligase的说明书进行操作。每个连接反应使用1μl pMD 18-T载体，约0.2pmol PCR产物，在10μl连接体系中4℃连接过夜或室温连接1h。 T4 DNA Ligase Buffer(2X) 5μl Purified PCR Product 1μl pMD 18-T Vector 1μl T4 DNA Ligase (5-10U/微升) 1μl ddH2O up to 10μl 5. 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) ① 挑取新鲜的E.coli.DH5α单菌落接种于一个含有10 ml LB液体培养基（不含抗生素）的试管中，于37℃恒温振荡（200 rpm）培养约4h(OD=0.2~0.4)，取出后立即将其冰浴10min。 ② 在无菌条件下将冰浴后的菌液吸取1ml到冰冷的1.5ml无菌离心管中，于4℃下10000g离心1min，回收细菌。 ③ 每管中加入500 μl于4℃下预冷的CaCl2重悬沉淀，冰浴30min，于4℃下10000g离心1min，回收细菌沉淀物。 ④ 每管加入200 μl冰预冷的CaCl2，混匀即为感受态细胞，置4℃冰箱备用。 6. 重组质粒转化大肠杆菌 ① 取10 μl连接产物，加入内装100 μl感受态细胞的离心管中，轻弹管壁混匀，冰浴30 min。 ② 42℃热击90s后，迅速将离心管冰浴3~5min。 ③ 加入1 ml不含抗生素的LB液体培养基，混匀，于37 ℃下振荡培养（180 rpm）45 min。 ④ 4℃下，10000 g，离心1 min，吸出500 μl上清液弃去，再混匀，取200 μl涂布于含有100 μg/ml氨苄青霉素的LB培养基平板上（事先涂布4μl浓度为200 mg/mg IPTG和20μl浓度为40 mg/ml X-gal），待菌液被培养基完全吸收后，倒置平板于37℃培养12~16h，直至出现单菌落。再将培养皿置于4℃，使其完全显色（即出现蓝、白斑）。 ⑤ 连接产物转化实验的同时，以等体积的ddH2O代替连接产物，其操作同上，分别涂布于含抗生素和不含抗生素的LB平板上，分别作为阴性对照和阳性对照。 7. 重组子克隆的鉴定（本部分视实验进程而定） 挑取可能含有目的片段的白斑，接种到5 ml LB/Amp液体培养基中，37℃ 220 rpm摇床培养过夜。采用碱裂解法小量提取菌液质粒DNA，进行PCR扩增，检测PCR产物是否连接到载体中。 附：TBE电泳缓冲液的配制 5×TBE（5倍体积的TBE贮存液） 配1000ml 5×TBE： Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5mol/l EDTA 20ml（pH 8.0）